陳廣勇，韓乾杰，張玲玲，李 慧，楊彩梅,*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，浙江省畜禽綠色生態(tài)健康養(yǎng)殖技術(shù)研究重點實驗室，動物健康互聯(lián)網(wǎng)檢測技術(shù)浙江省工程實驗室，浙江杭州 311300；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江安吉 311703）

植物多糖是從天然植物中提取的生物高分子活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)動物機體免疫、抑菌抗病毒和恢復(fù)其腸道上皮細(xì)胞的活力等作用[1]。人參多糖（Ginseng Polysaccharide，GPS）是人參根莖提取人參皂甙后剩余部分中提煉而來，對于患有輪狀病毒的小鼠，GPS 能夠減輕其癥狀，且使受到損傷腸道上皮恢復(fù)正常功能[2]。飼糧中添加植物多糖能改善斷奶仔豬的生長速度，增強細(xì)胞免疫和體液免疫功能和Thl 類細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ）和Th2 類細(xì)胞因子的分泌量，逆轉(zhuǎn)免疫抑制[3]。GPS 可以改善大鼠抗生素相關(guān)腹瀉結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)變化并且改善炎性腸病結(jié)腸損傷，改善硫酸葡聚糖鈉（DextranSulphate Sodium，DSS）造成的結(jié)腸炎性水平[4]。GPS能夠改善創(chuàng)傷性膿毒癥患者的免疫功能，抑制或減輕炎性反應(yīng)[5]。目前，GPS 對于抗炎和免疫調(diào)節(jié)的影響雖有一定研究，但關(guān)于在應(yīng)激條件下GPS 對細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路的作用機理尚不清楚。本試驗旨在研究在LPS 刺激條件下，GPS 對應(yīng)激小鼠巨噬細(xì)胞形態(tài)及免疫功能的影響，為GPS 在免疫調(diào)節(jié)和緩解炎癥方面的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 GPS 市購，含量90%，其余10% 為輔料麥芽糊精，主要由葡萄糖、果糖和甘露聚糖等組成；細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS，來源于大腸桿菌，血清型O55:B5）購自于美國Sigma 公司。小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、白介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。

1.2 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng) 參考許丹等[6]方法，培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞，進(jìn)行計數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型的建立 根據(jù)李淑玲[7]的研究進(jìn)行LPS 濃度范圍探索，分別配制0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 μg/mL LPS 溶液，分別刺激RAW264.7 細(xì)胞，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，每個組別設(shè)置6 個重復(fù)，試驗終劑量為500 μL。觀察細(xì)胞形態(tài)記錄細(xì)胞數(shù)量，并且檢測其LDH 活性，隨著LPS 濃度升高到1.0 μg/mL，LDH 不發(fā)生明顯變化，因此選取1.0 μg/mL LPS 濃度用于RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型。

1.4 GPS 對RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)的影響 試驗設(shè)置1 個CON 組（對照組）及LPS 組（1 μg/mL LPS）；GPS 組（1 μg/mL LPS+1 mg/mL GPS）2 個試驗組，每組6 個重復(fù)。各組均使用無抗細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。LPS 組和GPS 組加250 μL 的LPS 刺激培養(yǎng)1 h 后，再添加250 μL GPS溶液，空白對照組添加等量細(xì)胞處理液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行顯微拍照。

1.5 GPS 對細(xì)胞生物酶活性和細(xì)胞促炎癥因子分泌功能的影響 試驗分為CON 組（對照組）、LPS 組（1 μg/mL LPS）、1 mg/mL GPS 組（1 μg/mL LPS+1 mg/mL GPS）、0.5 mg/mL GPS 組（1 μg/mL LPS+0.5 mg/mL GPS）、0.1 mg/mL GPS 組（1 μg/mL LPS+0.1 mg/mL GPS）5 個組，每組6 個重復(fù)。LPS 組、1 mg/mL GPS組、0.5 mg/mL GPS 組和0.1 mg/mL GPS 組添加250 μL的LPS 刺激培養(yǎng)1 h 后，GPS 組分別添加250 μL 不同濃度的GPS 溶液，CON 組和LPS 組添加細(xì)胞處理液至500 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)12、24、48 h。取細(xì)胞上清液，檢測LDH、AKP、ACP、TNF-α、IL-1β含量。

1.6 GPS 對炎癥細(xì)胞TLR4 信號通路基因表達(dá)量的影響試驗分為4 個組，每組6 個重復(fù)。CON（對照組）采用500 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液處理24 h，不采用LPS 刺激；GPS對照組采用500 μL 濃度為1 mg/mL 的GPS 培養(yǎng)液處理24 h；LPS 組采用250 μL 濃度為1 μg/mL 的LPS 刺激1 h，再添加250 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)23 h。參考戴先成等[8]的方法，用實時定量RT-PCR 方法測定TLR-4、NFκB、MyD88的mRNA 水平。參考韓乾杰[9]的方法，設(shè)計引物序列如表1，由杭州尚亞生物科技有限公司合成和驗證。

表1 實時熒光定量PCR 引物

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用單因子方差分析（One-Way ANOVA，LSD），以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響 由圖1 可見，在培養(yǎng)1 h 后，LPS 刺激組培養(yǎng)1 h 后RAW264.7細(xì)胞較輕程度的變形。在培養(yǎng)24 h 后，CON 組的RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)與1 h 前無顯著差異，均為橢球狀且24 h 后增殖能力良好；LPS 組細(xì)胞數(shù)量顯著降低，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜破損導(dǎo)致細(xì)胞液外泄。LPS 刺激后添加GPS，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖能力恢復(fù)至正常水平，與未添加GPS 差異顯著。

圖1 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

2.2 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞生物酶活性的影響 由表2 可得，LPS 處理后12、24、48 h，LPS 組的LDH 值均顯著高于空白對照組。與LPS 組相比，添加GPS 后LDH 值均顯著降低。

LPS 處理后的RAW264.7 細(xì)胞ACP 活性在12、24、48 h 均低于對照組（P＜0.05）。添加GPS 能夠提高巨噬細(xì)胞ACP 活性（P＜0.05）。LPS 誘導(dǎo)刺激后的RAW264.7 細(xì)胞分泌AKP 含量在12、24 h 均顯著低于對照組。高劑量GPS 組在12、24、48 h AKP 含量均高于LPS 組和對照組（P＜0.05）。

2.3 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 由表3 可知，RAW264.7 細(xì)胞在LPS 刺激下分泌的IL-1β和TNF-α水平升高（P＜0.05），在48 h 內(nèi)持續(xù)升高。GPS 能夠降低RAW264.7 受到LPS 刺激分泌促炎癥因子IL-1β和TNF-α的水平（P＜0.05）。相同時間內(nèi)，GPS 濃度越高，促炎癥因子降低越顯著。

2.4 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞TLR4 信號通路相關(guān)基因的影響 由表4 可知，當(dāng)給予LPS 誘導(dǎo)刺激后，RAW 264.7 細(xì) 胞TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA 表達(dá)量相較于對照組顯著升高。添加GPS mRNA 表達(dá)量均較LPS 組顯著降低。

表3 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞炎癥因子含量的影響 ng/L

表4 GPS 對LPS 刺激巨噬細(xì)胞信號通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響

3 討 論

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，通過非特異性識別抗原物質(zhì)，對病原體進(jìn)行吞噬作用，誘導(dǎo)免疫應(yīng)激，產(chǎn)生抗原遞呈，從而激活機體的免疫系統(tǒng)，實現(xiàn)免疫細(xì)胞對抗原分子識別、活化、增殖和分化，啟動免疫應(yīng)答[10]。

LPS 是一個由類脂A 和纖維素構(gòu)成的生物大分子，其中類脂A 是LPS 的毒性和生物活性中心，它由2 個葡萄胺、磷酸鹽和一定量的脂肪酸構(gòu)成，其分子量在10 000 以上[11]。LPS 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁特有的化學(xué)成分，是一種免疫激活劑，作用于動物細(xì)胞時會表現(xiàn)炎癥反應(yīng)[12]。正常情況下巨噬細(xì)胞可以通過各種刺激從靜息狀態(tài)到免疫反應(yīng)激活[13]。任琳等[14]研究表明，LPS 刺激巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌大量的炎癥因子，過量的炎癥因子會加速巨噬細(xì)胞的非程序性死亡，引起免疫應(yīng)激。多糖對機體的免疫調(diào)控作用主要為激活巨噬細(xì)胞、激活網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、激活T 細(xì)胞和B 細(xì)胞、激活補體、促進(jìn)干擾素的生成、促進(jìn)白細(xì)胞介素的生成等[15-16]。

Xu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖納米顆粒對LPS 處理的H9c2 細(xì)胞形態(tài)起到保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用LPS刺激單核巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞會發(fā)生形態(tài)的改變；添加GPS 可直接作用于免疫細(xì)胞，修復(fù)細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞恢復(fù)卵圓形，改善細(xì)胞膜破損，減少細(xì)胞液外溢，可顯著發(fā)揮抗炎作用。

LDH 是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志之一，它對巨噬細(xì)胞的吞噬作用有直接影響，吞噬過程需要糖酵解的能量，而激活LDH 可以加速糖酵解過程[18]。李異等[19]以LPS 刺激新生大鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LPS 能降低心肌細(xì)胞存活率，促進(jìn)LDH 釋放，表明LPS 刺激導(dǎo)致了心肌細(xì)胞損傷，LDH 含量升高表明細(xì)胞損傷程度增大。尹俊等[20]試驗發(fā)現(xiàn)柴胡多糖可呈濃度依賴性增強細(xì)胞活力，LDH 含量顯著降低，說明柴胡多糖對心肌損傷具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)GPS 顯著降低由于LPS 誘導(dǎo)產(chǎn)生的LDH，對于LPS 刺激的RAW264.7 形態(tài)改變細(xì)胞膜破損有較好的改善效果。

ACP 和 AKP 是2 種重要的機體功能調(diào)節(jié)酶，ACP廣泛分布于生物界，是一種磷酸酯酶，大量研究表明磷酸酶活力是細(xì)胞和體液免疫的綜合體現(xiàn)，也是衡量免疫功能和機體狀態(tài)的指標(biāo)，反映了機體對外源微生物侵染的防御能力[21]。Millar 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在蛋白（酶）的去磷酸化過程中，ACP 和 AKP 可能共同參與了細(xì)胞的增殖啟動。本研究發(fā)現(xiàn)APS 能夠提高ACP 和AKP的活性，增強了巨噬細(xì)胞對外源微生物侵染的防御能力。

由于巨噬細(xì)胞擁有Toll 樣受體和清道夫受體，它們對凝集素、脂蛋白、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、多糖和其他分子具有廣泛的配體特異性。另一方面，巨噬細(xì)胞在其膜上表達(dá)主要的組織相容性復(fù)合物（MHC）II 類分子，因此也向淋巴細(xì)胞呈遞抗原。所以巨噬細(xì)胞是最早與這些入侵者接觸的一些細(xì)胞，啟動針對微生物的免疫反應(yīng)。研究表明誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵信號通路為TLR4/NF-κB[23]。Kim 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與免疫抑制劑環(huán)磷酰胺治療組相比，刺松藻和紅參提取物混合物大大增加了iNOS、COX-2、TLR-4、IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ等免疫相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激后TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的轉(zhuǎn)錄量明顯上升，啟動免疫應(yīng)激，而添加GPS 能緩解免疫應(yīng)激，降低TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的轉(zhuǎn)錄量。

Evgenikos 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4的轉(zhuǎn)錄受到來自IL-1β正反饋，促炎癥因子被免疫細(xì)胞大量分泌，炎癥反應(yīng)開始加劇，中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞同時作用于腸道，加劇炎癥反應(yīng)。Wu 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，由LPS 刺激后巨噬細(xì)胞后，添加平菇多糖能夠顯著降低LDH、IL-1β和TNF-α水平，降低免疫應(yīng)激。TNF-α是巨噬細(xì)胞應(yīng)激時產(chǎn)生的小分子蛋白，具有炎癥介質(zhì)作用。IL-1β和TNF-α水平伴隨炎癥反應(yīng)加劇不斷升高，可以用來判斷炎癥反應(yīng)程度。Spielmann 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，患有潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中的TNF-α含量升高。Caillot 等[29]研究發(fā)現(xiàn)LPS 處理巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)NF-κB 表達(dá)顯著上升，黑莓多糖能夠顯著降低其表達(dá)，并且減少TNF-α和IL-1β分泌。本試驗發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激巨噬細(xì)胞，促進(jìn)TNF-α和IL-1β的分泌增加，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，GPS 通過降低TLR4、MyD88和NF-κBmRNA 的轉(zhuǎn)錄量從而減少免疫相關(guān)基因促炎癥因子 IL-1β和TNF-α水平，減少炎癥反應(yīng)，緩解過量應(yīng)激給機體帶來的損傷。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，添加GPS 可以改善LPS 刺激的小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的細(xì)胞形態(tài)，恢復(fù)細(xì)胞增殖；提高ACP 和AKP 活性；減少TLR4、MyD88和NF-κB基因的轉(zhuǎn)錄，抑制促炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌及表達(dá)，降低免疫應(yīng)激。