徐生陽，玉 柱

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

中國(guó)是世界第二大草原大國(guó)，天然草地中有飼用價(jià)值的牧草達(dá)6 000 多種[1]，所以天然牧草一直是我國(guó)草地畜牧業(yè)發(fā)展的重要支柱。相較于干草，天然牧草青貯適口性好，氣味芳香，可以減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高消化利用率[2]。但真菌的存在不利于優(yōu)質(zhì)天然牧草青貯的生產(chǎn)。青貯中的真菌主要是霉菌和酵母菌，酵母菌會(huì)造成干物質(zhì)和糖分的損失，其利用乳酸使得pH 升高，使得其他雜菌生長(zhǎng)；霉菌可以分解乳酸和糖，也可以分解纖維素及其他細(xì)胞壁成分，是導(dǎo)致青貯腐敗變壞的主要微生物[3]。有研究表明，孜然精油中含有具有選擇性抗菌作用的枯草醛和香芹醛，可以減少霉菌和酵母菌等有害微生物，是安全的天然添加劑[4]。熊家林等[5]認(rèn)為富馬酸單甲酯的pH 應(yīng)用范圍廣、用途廣、高效、低毒，而且抑菌能力強(qiáng)，對(duì)黃曲霉菌也有很強(qiáng)烈的抑制作用。胡元亮[6]認(rèn)為，將清熱型中草藥與化學(xué)添加劑相結(jié)合可能會(huì)取得更好的防霉效果，甘草為清熱型的中草藥。賈玉山等[7]認(rèn)為陳皮具有一定的防霉能力。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)孜然精油、富馬酸單甲酯及其與中草藥搭配使用的研究較少。本研究中使用孜然精油、陳皮、富馬酸單甲酯及其與中草藥的組合，探索適合天然牧草青貯的添加劑，為制作優(yōu)質(zhì)的天然牧草青貯提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 原料為抽穗期羊草為優(yōu)勢(shì)種群的天然牧草，于2019 年7 月10 日國(guó)家草地生態(tài)系統(tǒng)野外科學(xué)觀測(cè)站沽源基地刈割，試驗(yàn)時(shí)充分混勻；孜然精油來自河南新羅曼食品配料有限公司；富馬酸單甲酯來自江蘇瑞多生物工程有限公司；甘草粉來自鹽城陳氏食品有限公司；陳皮粉來自亳州市德永堂生物科技有限公司；瘤胃液來自北京中地畜牧科技有限公司的瘺管奶牛。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)設(shè)置6 個(gè)處理，將收獲的天然牧草切碎至1 cm 左右，混勻，對(duì)照組（CK）不添加任何添加劑，試驗(yàn)組分別加入孜然精油（0.5 g/kg）、富馬酸單甲酯（1 g/kg）、陳皮粉（3 g/kg）、富馬酸單甲酯（0.5 g/kg）+陳皮粉（2 g/kg）、富馬酸單甲酯（0.5 g/kg）+甘草粉（3 g/kg），再次混勻，取500 g 裝入1 L 的青貯桶中密封，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。青貯40 d 后開封，取樣分析。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法 采用田吉鵬[8]的方法進(jìn)行酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)；采用雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)測(cè)定pH[9]；采用島津LC-20A 型高效液相色譜儀（色譜柱：KC-811 column，Shimadzu，日本；檢測(cè)器：SPD-M10AVP；流動(dòng)相：3 mmol/L 高氯酸，流速1 mL/min，柱溫50℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量5 μL）分析乳酸（LA）和乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）[10]；采用苯酚-次氯酸鈉法測(cè)定氨態(tài)氮/總氮（AN/TN）[11]；采用張麗英[12]的方法計(jì)算干物質(zhì)（DM）含量；采用凱氏定氮法[13]測(cè)定粗蛋白質(zhì)（CP）含量，采用范氏法測(cè)定中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量[14]。

干物質(zhì)消化率（IVDMD）的測(cè)定[15]：準(zhǔn)確稱取1.0 g草樣置于經(jīng)丙酮浸泡后自然晾干的纖維袋，而后放入體外模擬培養(yǎng)箱的消化罐中，每個(gè)罐中放入24 個(gè)樣品和1 個(gè)空白對(duì)照。然后在罐中加入AB 緩沖液（A 緩沖液1 330 mL：KH2PO410 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，Urea 0.5 g/L；B 緩沖液266 mL：Na2CO315 g/L，Na2S·9H2O 1 g/L），再加入400 mL 已經(jīng)提取的瘤胃液，最后向罐中通CO2直至充滿整個(gè)罐體，并蓋好蓋子。隨后將消化罐置于體外模擬培養(yǎng)箱內(nèi)，39℃發(fā)酵48 h，樣品取出后用蒸餾水沖洗干凈，然后放入105℃烘箱中烘干4 h，稱重并計(jì)算。IVDMD=（樣品DM 量-體外培養(yǎng)后DM 量）/樣品DM 量

總產(chǎn)氣量（Vx）的測(cè)定：采用ANKOM RFS 產(chǎn)氣測(cè)量?jī)x器測(cè)定，準(zhǔn)確稱取1.0 g 草樣置于試驗(yàn)?zāi)K的模塊瓶中，向模塊瓶中加入AB 緩沖液（A 緩沖液83.3 mL、B 緩沖液16.7 mL），再加入25 mL 已經(jīng)提取的瘤胃液，通入CO2直至充滿整個(gè)模塊瓶，隨后將模塊瓶置于39℃恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)定儀器配套軟件并開始測(cè)定，發(fā)酵48 h，軟件會(huì)自動(dòng)記錄各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的壓力值。最后通過壓力值來計(jì)算總產(chǎn)氣量。

Vx=Vj×Ppsi×0.068 004 084

其中，Vx 為39℃時(shí)的產(chǎn)氣體積（mL）；Vj 為模塊瓶?jī)?nèi)液面上部空間的體積（mL）；Ppsi 為軟件記錄的累積壓力（psi）。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用Excel 2007 計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用Duncan's 法對(duì)各測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用Sigmaplot 14 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加劑對(duì)天然牧草青貯真菌數(shù)量的影響 由表1 可知，添加孜然精油后青貯中酵母菌數(shù)量低于對(duì)照組（P＜0.05），在其他添加劑處理組中沒有發(fā)現(xiàn)酵母菌。在各個(gè)處理組中均沒有發(fā)現(xiàn)霉菌。

2.2 不同添加劑對(duì)天然牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響 由表2 可知，各試驗(yàn)組pH 高于對(duì)照組（P＜0.05）。富馬酸單甲酯組和陳皮組的pH 低于孜然精油組、富馬酸單甲酯+陳皮組、富馬酸單甲酯+甘草處理組（P＜0.05）。各處理組中AN/TN 值無顯著差異。對(duì)照組LA 含量高于除陳皮組之外的其他處理組（P＜0.05），富馬酸單甲酯+甘草組中LA 含量最低（P＜0.05）。對(duì)照組和陳皮組中AA 含量高于孜然精油組、富馬酸單甲酯+陳皮組和富馬酸單甲酯+甘草組（P＜0.05）。

2.3 不同添加劑對(duì)天然牧草青貯營(yíng)養(yǎng)成分、干物質(zhì)消化率和總產(chǎn)氣量的影響 由表3 可知，孜然精油組中DM含量較對(duì)照組提高了10.15%（P＜0.05），其余處理組中DM 含量與對(duì)照組無顯著差異。富馬酸單甲酯+陳皮組中NDF 含量低于對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組和富馬酸單甲酯+陳皮組中ADF 含量最低（P＜0.05）。添加孜然精油、富馬酸單甲酯、陳皮、富馬酸單甲酯+陳皮和富馬酸單甲酯+甘草的CP 含量較對(duì)照組分別顯著提高了24.97%、17.50%、22.80%、39.62% 和29.04%（P＜0.05），其中富馬酸單甲酯+陳皮處理組中CP含量最高。由表3 可知，添加孜然精油、富馬酸單甲酯、陳皮、富馬酸單甲酯+陳皮和富馬酸單甲酯+甘草后IVDMD 較對(duì)照組分別提高了10.58%、6.84%、10.65%、9.22% 和12.13%（P＜0.05）。由圖1 可知，隨著時(shí)間的增加，各處理中總產(chǎn)氣量不斷增加，在發(fā)酵0～4 h 時(shí)，各處理的產(chǎn)氣速率較大；在發(fā)酵48 h 后，富馬酸單甲酯組中總產(chǎn)氣量高于其他處理組，富馬酸單甲酯+陳皮組中總產(chǎn)氣量最低。

表1 天然牧草青貯的真菌數(shù)量 log10CFU/g

表2 不同處理天然牧草青貯的發(fā)酵品質(zhì)

表3 不同處理天然牧草青貯營(yíng)養(yǎng)成分和 IVDMD

圖1 不同處理天然牧草青貯的總產(chǎn)氣量

3 討 論

3.1 不同添加劑對(duì)天然牧草青貯真菌數(shù)量的影響 霉菌和酵母菌會(huì)造成青貯干物質(zhì)的損失和pH 上升。而青貯的酸性環(huán)境可以有效抑制飼料作物上附著的一些有害微生物，pH 上升會(huì)引起其他雜菌的生長(zhǎng)[16]。霉菌不但可以造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失，也會(huì)產(chǎn)生霉菌毒素造成家畜霉菌毒素中毒，而且一般無特效藥物來治療霉菌毒素中毒[17]。本研究中，所有處理中均沒有發(fā)現(xiàn)霉菌，說明各處理中的青貯較為安全。Turan 等[4]認(rèn)為孜然精油可以抑制酵母菌等有害微生物，本研究的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。本研究中，孜然精油處理組中酵母菌數(shù)量顯著低于對(duì)照組；除孜然精油處理組之外，其他添加劑處理組中均沒有發(fā)現(xiàn)酵母菌。說明孜然精油對(duì)酵母菌有一定的抑制作用，但其他添加劑的抑制作用更明顯。

3.2 不同添加劑對(duì)天然牧草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響 pH和AN/TN 是評(píng)價(jià)青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標(biāo)。通常情況下認(rèn)為青貯成功的青貯飼料其pH 應(yīng)該在4.2 以下，AN/TN 應(yīng)該在10%以下[18-19]。本研究中所有處理均符合以上標(biāo)準(zhǔn)，屬于發(fā)酵成功的青貯飼料。本研究中添加了富馬酸單甲酯及其組合添加劑后pH 有所升高，可能是由于富馬酸單甲酯具有較強(qiáng)的抑菌作用，抑制了乳酸菌數(shù)量[5]。而添加孜然精油和陳皮后天然牧草青貯中pH 顯著高于對(duì)照組，也可能是由其抗菌性能造成[4,20]。AN/TN 主要反映青貯中氨基酸和蛋白質(zhì)分解的程度，分解程度越大則比值越大，說明青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)就越差[21]。本研究中，所有處理AN/TN 均小于10%，說明其氨基酸和蛋白質(zhì)保存較好。LA 是青貯飼料發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有益酸，也是飼料中碳水化合物在瘤胃中被瘤胃微生物發(fā)酵產(chǎn)生AA、PA 等揮發(fā)酸的中間代謝產(chǎn)物[22]。本研究中除陳皮組外，添加其他添加劑后LA 含量均低于對(duì)照組。LA 是青貯飼料中最主要的酸性物質(zhì)，青貯飼料中有機(jī)酸含量的直觀反映是pH，所以LA 含量低的原因可能與pH 高有關(guān)。

3.3 不同添加劑對(duì)天然牧草青貯營(yíng)養(yǎng)成分、IVDMD 和總產(chǎn)氣量的影響 植物性飼料經(jīng)過中性洗滌劑和酸性洗滌劑分解后的剩余物是NDF 和ADF，中性洗滌劑洗去的部分為中性洗滌可溶物，主要有糖、脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉，還包括部分可溶性纖維素和礦物鹽，這些營(yíng)養(yǎng)成分易被消化吸收且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，NDF 和ADF還與飼料的適口性和消化率有關(guān)，NDF 和ADF 含量越多，可以被牲畜吸收的營(yíng)養(yǎng)成分就越少[20,23]。本研究中，添加富馬酸單甲酯+陳皮后NDF 含量顯著低于對(duì)照組，ADF 含量與對(duì)照組無顯著差異，說明添加富馬酸單甲酯+陳皮有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保存。在天然牧草中，CP 是評(píng)價(jià)牧草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)，CP 含量越高牧草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值就越高[15]。本研究中，添加富馬酸單甲酯+陳皮后牧草青貯中CP 含量較對(duì)照組顯著提高了39.62%，說明富馬酸單甲酯+陳皮有利于CP 的保存。添加孜然精油后，天然牧草青貯中DM 和CP 含量較對(duì)照組分別顯著提高了10.15% 和24.97%，ADF 和NDF與對(duì)照組無顯著差異，說明添加孜然精油有利于天然牧草青貯營(yíng)養(yǎng)成分的保存。

IVDMD 是評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和可消化性能的重要指標(biāo)之一[23-25]，主要是指脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，IVDMD 越高，說明動(dòng)物越易于消化飼料，飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也就越高[1]。王瑩[15]研究了13 種有代表性的牧草，發(fā)現(xiàn)其體外消化率的范圍為25.88%～76.62%。本研究中，各處理的消化率均在該范圍中。本試驗(yàn)所有添加劑均顯著提高了天然牧草青貯的IVDMD，添加孜然精油、富馬酸單甲酯、陳皮、富馬酸單甲酯+陳皮和富馬酸單甲酯+甘草后IVDMD 分別提高了10.58%、6.84%、10.65%、9.22%和12.13%，說明添加劑有利于提高天然牧草青貯的可消化性能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

目前，體外產(chǎn)氣法是評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物飼料飼用價(jià)值的重要手段，其主要通過不同發(fā)酵時(shí)間的產(chǎn)氣量來判斷飼料的消化性能[26]。本研究中，各處理的產(chǎn)氣速率在發(fā)酵12～24 h 時(shí)具有較高的產(chǎn)氣速率，這與王瑩[15]的研究結(jié)果相類似。在發(fā)酵48 h 之后，富馬酸單甲酯處理組的產(chǎn)氣量達(dá)到最高，說明添加富馬酸單甲酯后有利于提高天然牧草青貯中的可發(fā)酵的碳水化合物和易發(fā)酵成分。

4 結(jié) 論

本研究表明，添加劑均有利于抑制酵母菌，利于蛋白質(zhì)的保存和IVDMD 的提高，其中添加孜然精油后牧草青貯的DM、CP 和IVDMD 分別較對(duì)照組提高了10.15%、24.97%和10.58%，添加富馬酸單甲酯+陳皮后CP 和IVDMD 分別較對(duì)照組提高了39.62%和9.22%，添加孜然精油和富馬酸單甲酯+陳皮后天然牧草青貯的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和IVDMD 最好。