郝凌魁，劉世雄，李冬芳，于春微，李松建，陳 灰，高 民，胡紅蓮，劉大程*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

近幾年生物飼料日益受到研究者關(guān)注。生物飼料不僅可以改善飼糧適口性、增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)消化道微生態(tài)平衡、提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，而且可以提高飼料的利用率、改善畜舍環(huán)境和降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子[1-4]。酵母發(fā)酵飼料為本課題組研制，由酵母菌為主的高活性菌株經(jīng)液態(tài)富集培養(yǎng)、固態(tài)厭氧發(fā)酵及酵母破壁等發(fā)酵工藝生產(chǎn)而成，主要含有甘露聚糖、β-葡聚糖、多肽、有機(jī)酸和氨基酸5 種主效成分。前期試驗(yàn)表明酵母發(fā)酵飼料不僅能提高肉羊的采食量和生產(chǎn)性能，而且可以增強(qiáng)肉羊免疫功能和抗應(yīng)激能力[5-9]。反芻動(dòng)物瘤胃的功能是通過(guò)瘤胃微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10-11]，肉羊采食酵母發(fā)酵飼料后對(duì)瘤胃內(nèi)主要功能菌的影響需要進(jìn)一步闡明。基于此，本試驗(yàn)旨在研究酵母發(fā)酵飼料對(duì)瘤胃菌群數(shù)量的影響，為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酵母發(fā)酵飼料的制作 選取麩皮、玉米、棉籽粕、米糠、玉米胚芽粕、白玉米皮等原料作為發(fā)酵底物[5-6]。將活性釀酒酵母菌液（BC、XR4）以15%的接種量接入發(fā)酵底物中，加水使最終含水量為45%，然后進(jìn)行固態(tài)堆積發(fā)酵。料高60 cm、發(fā)酵時(shí)間48 h、翻料控制發(fā)酵溫度在35℃左右。其主要技術(shù)指標(biāo)：葡聚糖≥145 mg/100g，甘露聚糖≥71 mg/100 g，多肽≥1.3 mg/g，氨基酸≥15.27 mg/100g，有機(jī)酸≥1.48 mg/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧 選用10 只安裝永久性瘤胃瘺管（內(nèi)徑4 cm）且體重約40 kg 的14 月齡蒙古羯羊，單籠飼養(yǎng)，自由飲水。將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組5 只羊。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧+酵母發(fā)酵飼料，自由采食。課題組前期實(shí)踐證明，酵母發(fā)酵飼料的最適添加范圍是10%～15%[5]，本試驗(yàn)中添加量設(shè)計(jì)為日糧的13.37%。預(yù)試期15 d，正試期5 d，每天06:00 和18:00 飼喂。參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816—2004）配制試驗(yàn)飼糧。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 采集樣品 預(yù)試期結(jié)束后，正試期開始采樣，每天通過(guò)瘤胃瘺管在晨飼后0、3、6、9、12 h 采樣，每天采集一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共采5 次。用無(wú)菌鑷子夾取瘤胃內(nèi)容物中的飼草料殘?jiān)?，并用?fù)壓裝置抽取瘤胃中上層的瘤胃液和食糜，共計(jì)50 mL。放入經(jīng)無(wú)菌水沖洗的自動(dòng)勻漿機(jī)中攪拌勻漿15 s，后裝入無(wú)菌自封袋中，加入等體積磷酸緩沖液（pH 6.0，0.2 mol/L），冰浴拍打揉搓5 min，經(jīng)2 層紗布過(guò)濾后4℃、1 000×g、15 min 離心取上清；所得上清液經(jīng)4℃、10 000×g、25 min 再次離心后棄上清得沉淀加50 mL 緩沖液懸浮，經(jīng)過(guò)液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量法的檢測(cè)

1.3.2.1 DNA 基因組提取及PCR 擴(kuò)增 采用磁珠法土壤和糞便基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN，DP712）提取樣品基因組DNA，然后以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：PCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 12 μL；反應(yīng)條件：95 ℃，3 min 變性；95 ℃，30 s；Tm，30 s；72℃，延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。查找GenBank 中目的基因的序列，利用Primer premier 等基因編輯軟件并結(jié)合參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)目的基因的引物和探針序列，PCR 引物、探針序列和退火溫度見表2。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段大小后，采用膠回收試劑盒（AXYGEN，AP-GX-50）回收PCR產(chǎn)物。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3.2.2 qPCR 試驗(yàn) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Taqman探針?lè)ń^對(duì)定量。根據(jù)目的片段大小，選用pMD-19T為載體質(zhì)粒進(jìn)行目的片段的連接，隨后轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5-α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp 抗性LB 平板鑒定含有各目的片段的陽(yáng)性克隆菌落后，接種于LB 液體培養(yǎng)基（含Amp）中，37 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGEN，DP103）提取重組質(zhì)粒。委托華大公司測(cè)序，在GenBank 上使用Blast 比對(duì)測(cè)序結(jié)果。利用分光光度計(jì)檢測(cè)比對(duì)結(jié)果相符的各質(zhì)粒的核酸濃度，以10 倍倍比稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)品以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

應(yīng)用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time System 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光信號(hào)值定量檢測(cè)。反應(yīng)體系總體積為50 μL：Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2×）25 μL，上、下游引物各（10 μmol/L） 1 μL，探針2 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.5 μL，DNA 模板4 μL，ddH2O 16.5 μL。反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；Tm 34 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.3.3 Illumina MiSeq 16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)根據(jù)E.Z.N.A.?soil 試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA,U.S.）對(duì)各樣品進(jìn)行DNA 抽提，用338F（5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3 ′）和806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）引物對(duì)V3～V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min，27 個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）。擴(kuò)增體系為20 μL：4 μL Fast Pfu 緩沖液（5×），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.8 μL 引物（5 μmol/L），0.4 μL Fast Pfu 聚合酶；10 ng DNA 模板。

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2% 瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST （Promega，USA）進(jìn)行檢測(cè)定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300 的文庫(kù)。利用Illumina 公司的 Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接，使用UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/），根據(jù) 97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行 OTU 聚類；使用 UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用 RDP classifier（http://rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Excel 2010 整理后，使用SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果

2.1.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 如圖1 所示，各陽(yáng)性克隆菌落所提取質(zhì)粒擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物條帶單一，與各自對(duì)應(yīng)的目的片段大小相符。進(jìn)行序列同源性分析比對(duì)，相似性均大于99%，可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

表2 瘤胃細(xì)菌引物、探針及退火溫度

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.2 熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 各菌的熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y溶纖維丁酸弧菌=-3.506logX+46.338；Y黃色瘤胃球菌=-3.637logX+46.800；Y產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌=-3.586logX+49.889；Y埃氏巨型球菌=-3.616logX+49.603；Y白色瘤胃球菌=-3.341logX+41.441；Y棲瘤胃普雷沃氏菌=-3.341X+41.044；Y嗜淀粉瘤胃球菌=-3.319X+41.417；Y反芻獸甲烷短桿菌=-3.625X+44.434；Y牛鏈球菌=-3.282X+45.000。式中，X表示拷貝數(shù)，Y表示Ct 值，各方程的R2值均大于等于0.999。

2.1.3 熒光定量PCR 測(cè)定結(jié)果 由表3 可知，試驗(yàn)組的溶纖維丁酸弧菌在晨飼后3 h 數(shù)量最大（27.57×107copies/mL），且在晨飼后3、9、12 h 均高于對(duì)照組（P＜0.05）；但在晨飼后6 h 試驗(yàn)組中溶纖維丁酸弧菌數(shù)量低于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組中黃色瘤胃球菌在晨飼后9 h 數(shù)量最大（4.32×107copies/mL），且在晨飼后6、9、12 h均高于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌在晨飼后6 h 數(shù)量最大（4.27×107copies/mL），3、6 h 均高于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)組中埃氏巨型球菌的數(shù)量在晨飼后6 h（P＜0.01）、在晨飼后9 h（P＜0.05）高于對(duì)照組。試驗(yàn)組白色瘤胃球菌的數(shù)量最高值在晨飼后9 h（22.30×104copies/mL），高于對(duì)照組中的最高值（18.67×104copies/mL）（P＞0.05）。試驗(yàn)組中牛鏈球菌的數(shù)量在晨飼后3 h 高于對(duì)照組（P＜0.01）。在試驗(yàn)組中嗜淀粉瘤胃桿菌的數(shù)量與對(duì)照組差異不顯著。試驗(yàn)組棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量在晨飼后3 h 和6 h 均高于對(duì)照組（P＜0.01）。試驗(yàn)組中反芻獸甲烷短桿菌的數(shù)量在晨飼后0 h 高于對(duì)照組，但在6 h 低于對(duì)照組中（P＜0.01），且3、9、12 h 均小于對(duì)照組的數(shù)量（P＞0.05）。

表3 熒光定量PCR 結(jié)果

2.2 Illumina MiSeq 16s rRNA 高通量測(cè)序結(jié)果

2.2.1 樣本DNA 和測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量結(jié)果顯示，提取的DNA 純度良好，PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，濃度合適。通過(guò)16S rRNA基因測(cè)序質(zhì)控篩選后進(jìn)行測(cè)序深度檢測(cè)，所有樣本的Shannon 稀釋曲線顯示曲線趨向平坦（圖2），說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

圖2 Shannon 稀釋曲線圖（相似閾值為 97%）

2.2.2 Alpha 多樣性分析 由表4 可知，試驗(yàn)組的Shannon指數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.01）；試驗(yàn)組的Simpson 指數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）；Sobs 指數(shù)、Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)在兩組中沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明試驗(yàn)組的多樣性顯著低于對(duì)照組，而豐富度沒(méi)有差異。

2.2.3 Venn 圖分析 如圖3 所示，在相似度為97% 的水平下，2 組共聚類得到2 306 個(gè)OUT，對(duì)照組和試驗(yàn)組分別為2 179 個(gè)和2 116 個(gè)，共用1 989 個(gè)OUT，占OUT 總數(shù)的86.25%，獨(dú)有的OUT 數(shù)分別為190 個(gè)和127 個(gè)，分別占OUT 總數(shù)的8.23% 和5.51%，表明2組 OUT 組成具有一定的相似度，但也存在差異。

表4 Alpha 多樣性分析結(jié)果

圖3 OUT 水平下瘤胃微生物Venn 圖

2.2.4 群落組成分析 經(jīng)過(guò)物種分類學(xué)比較，樣品共包含20 門，34 綱，63 目，93 科，235 屬。

2.2.4.1 門水平 如圖4 所示，在門水平分類上，占主導(dǎo)的為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、螺旋體門（Spirochaetae）和纖維桿菌門（Fibrobacteres）。此外，軟壁菌門（Tenericutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和變形菌門（Proteobacteria）占比均高于1%。擬桿菌門在試驗(yàn)組中最大值為64.05%，高于在對(duì)照組中的最大值57.48%（P＞0.05）。厚壁菌門在試驗(yàn)組中最大值為32.29%，低于對(duì)照組中的最大值34.06%（P＞0.05）。纖維桿菌門與螺旋體門在對(duì)照組與試驗(yàn)組中的相對(duì)豐度最高值均在0 h。纖維桿菌門在試驗(yàn)組中的平均值（4.02%）高于對(duì)照組（3.40%）；螺旋體門在試驗(yàn)組中的平均值（5.08%）高于對(duì)照組（4.41%）（P＞0.05）。其余相對(duì)豐度低于0.1%的門類被聚集到一起（others＜0.1%）。

圖4 瘤胃菌群門水平相對(duì)豐度

2.2.4.2 屬水平 如圖5 所示，優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬_1（Prevotella_1）、理研菌科_RC9 菌屬（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、未排位擬桿菌_BS11 菌屬（norank_f_Bacteroidales_BS11_gut_group）、密螺旋體菌屬_2（Treponema_2）和纖維桿菌屬（Fibrobacter）等，其余相對(duì)豐度低于1%的門類被聚集到一起（others＜1%）。普雷沃氏菌屬_1 在試驗(yàn)組中平均值（34.34%）高于對(duì)照組（33.52%）（P＞0.05）。理研菌科_RC9 菌屬在試驗(yàn)組中平均值（12.03%）高于對(duì)照組（6.91%）（P＜0.05）。纖維桿菌屬在對(duì)照組的平均值（4.14%）高于試驗(yàn)組（3.39%）（P＞0.05）。瘤胃球菌科_NK4A214 菌屬（Ruminococcaceae_NK4A214_group）在對(duì)照組的平均值（3.14%）高于試驗(yàn)組（3.06%）（P＞0.05）。丁酸弧菌屬_2（Butyrivibrio_2）在試驗(yàn)組的平均值（1.72%）高于對(duì)照組（1.20%）（P＞0.05）。丹毒進(jìn)菌科_UCG-004 菌屬（Erysipelotrichaceae_UCG-004）在試驗(yàn)組的平均值（1.47%）高于對(duì)照組（0.77%）（P＜0.05）。韋榮球菌科_UCG-001 菌屬（Veillonellaceae_UCG-001）在試驗(yàn)組的平均值（0.65%）低于對(duì)照組（1.31%）（P＜0.05）?？死锼闺鷮賍R-7（Christe nsenellaceae_R-7_group）在試驗(yàn)組中的平均值（0.79%）低于對(duì)照組（1.12%）（P＜0.05）。

圖5 瘤胃菌群屬水平相對(duì)豐度

2.2.5 PLS-DA 分析 PLS-DA 分析作為樣本分組分析中的一種，具有忽略組內(nèi)的隨機(jī)差異，突出組間系統(tǒng)差異的特點(diǎn)。各點(diǎn)之間的距離代表各個(gè)樣本組成的相似性與差異性，其距離越近，樣本的相似性越高；距離越遠(yuǎn)，樣本的相似性越低。如圖6 所示，2 個(gè)組內(nèi)各點(diǎn)的距離接近，具有相似性，而兩組間的距離偏遠(yuǎn)，具有一定的差異性。

圖6 PLS-DA 分析結(jié)果圖

3 討 論

3.1 瘤胃液采樣方法的分析 反芻動(dòng)物瘤胃中微生物種群根據(jù)寄生的位置不同可分為固相瘤胃微生物、液相瘤胃微生物和貼附于瘤胃壁的微生物三類。在瘤胃液采集工作中，如單一抽取瘤胃液相微生物作為樣本進(jìn)行試驗(yàn)分析，固態(tài)內(nèi)容物上黏附的大量細(xì)菌就可能沒(méi)有被取樣，樣品出現(xiàn)偏差，整體數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性會(huì)受到影響，因此，要根據(jù)微生物寄生的不同位置，采集不同瘤胃內(nèi)容物混勻后才可作為樣品[12-13]。本試驗(yàn)采用對(duì)瘤胃內(nèi)容物殘?jiān)?、食糜和瘤胃液結(jié)合，并用緩沖液清洗的方法，獲得較高代表性的瘤胃菌群樣品。

3.2 9 種瘤胃菌數(shù)量變化分析 反芻動(dòng)物的瘤胃器官是一個(gè)高效的發(fā)酵系統(tǒng)，其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于可以降解植物源類纖維素。大量的微生物寄生于瘤胃中，參與消化和吸收纖維素類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程。其中，黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌占據(jù)著主導(dǎo)地位。經(jīng)過(guò)植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、或酵母菌等微生物發(fā)酵處理的飼料飼喂反芻動(dòng)物后，該3 種菌的數(shù)量均有極顯著提高[14-16]。Hoang 等[17]試驗(yàn)表明，由枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母菌和乳酸菌組成的復(fù)合菌活性添加劑可提高機(jī)體對(duì)粗纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率，進(jìn)而提高飼料轉(zhuǎn)化效率。本試驗(yàn)中，酵母發(fā)酵飼料增加了黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量，可提高機(jī)體對(duì)纖維素類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率。除了纖維素類分解菌之外，本研究中溶纖維丁酸弧菌、棲瘤胃普雷沃氏菌和埃氏巨球型菌的數(shù)量也在試驗(yàn)組中有所增加。溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌具有淀粉降解酶活性和蛋白降解酶活性，可以降解蛋白質(zhì)和淀粉等多糖類大分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18]。溶纖維丁酸弧菌還可參與體內(nèi)的氫化作用，將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變成飽和脂肪酸，提高機(jī)體的增重效果[19]。酵母發(fā)酵飼料中富含甘露聚糖、葡聚糖和氨基酸，可誘導(dǎo)溶纖維丁酸弧菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的大量增殖。在現(xiàn)代肉羊養(yǎng)殖業(yè)中，大比例使用精飼料以達(dá)到短時(shí)間增重的目的，使得瘤胃中牛鏈球菌快速增殖生長(zhǎng)并產(chǎn)生乳酸，易造成肉羊瘤胃酸中毒的現(xiàn)象。以氨基酸為氮源的埃氏巨球型菌可代謝乳酸，該菌在防止乳酸性酸中毒、提高淀粉的利用率、參與氨基酸的脫氨脫羧反應(yīng)以及形成揮發(fā)性支鏈脂肪酸的過(guò)程中都發(fā)揮重要的作用[20]。酵母發(fā)酵飼料提高了埃氏巨球型菌數(shù)量，可提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率，也可預(yù)防瘤胃酸中毒，維持瘤胃微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，酵母細(xì)胞壁的特殊空間結(jié)構(gòu)可以吸附黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等霉菌毒素。酵母細(xì)胞壁中的多糖類物質(zhì)能競(jìng)爭(zhēng)性地阻止病原菌在腸壁上的定植，可有效減少金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等病原菌數(shù)量，有利于瘤胃細(xì)菌的繁殖并改善瘤胃微生態(tài)環(huán)境[21-25]。微生物發(fā)酵飼料對(duì)牛鏈球菌影響的報(bào)道并不一致[8,26]，造成差異的原因可能與發(fā)酵底物、發(fā)酵菌種以及試驗(yàn)動(dòng)物的品種有關(guān)。本文中酵母發(fā)酵飼料增加了牛鏈球菌數(shù)量。反芻獸甲烷短桿菌是瘤胃中最主要的產(chǎn)甲烷菌。蘋果酸或延胡索酸等有機(jī)酸物質(zhì)可通過(guò)氫代謝途徑產(chǎn)生丙酸和共軛亞油酸，消耗氫離子來(lái)抑制甲烷的生成[27]。有研究表明飼糧中添加乳酸菌或活性干酵母可降低產(chǎn)甲烷短桿菌屬的數(shù)量，降低了甲烷排放量約40%[28-29]。本研究中的酵母發(fā)酵飼料也可顯著降低反芻獸甲烷短桿菌數(shù)量，減輕畜牧生產(chǎn)中甲烷對(duì)外界環(huán)境的污染。

3.3 16S rRNA 基因高通量測(cè)序結(jié)果的分析 諸多學(xué)者利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，生物飼料可提高瘤胃菌群的多樣性與豐度[30]。本研究結(jié)果與之相悖，可能與飼料的高消化率與高效的代謝途徑相關(guān)。部分菌群因?yàn)榫哂懈咝Ш?jiǎn)便的代謝通路，可在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化過(guò)程中占據(jù)主導(dǎo)地位，在短時(shí)間內(nèi)積累大量的代謝產(chǎn)物。高效的微生物菌群并不會(huì)出現(xiàn)冗雜的結(jié)構(gòu)層次，能快速地滿足機(jī)體能量需求即可[31]。Bagheri[32]認(rèn)為玄參提取物和莫能菌素可使菌群多樣性降低。本研究中酵母發(fā)酵飼料降低了瘤胃微生物菌群的多樣性，使瘤胃細(xì)菌更有效率地降解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這可能是其能夠顯著提高綿羊生長(zhǎng)性能和免疫功能的原因[5]。在門水平上，擬桿菌門和厚壁菌門是反芻動(dòng)物瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌門[33]。其次，根據(jù)物種、日糧、年齡和生長(zhǎng)環(huán)境等條件的不同，纖維桿菌門和密螺旋體門會(huì)出現(xiàn)不同的優(yōu)勢(shì)占比。擬桿菌門在非纖維物質(zhì)的降解中發(fā)揮重要作用，而厚壁菌門、螺旋菌門和纖維桿菌門能夠降解纖維素、半纖維素、果膠等，對(duì)植物類纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸（VFA）產(chǎn)生重要影響[34]。有研究表明隨著酵母培養(yǎng)物（Yeast Culture，YC）添加水平的升高，擬桿菌門相對(duì)豐度逐漸增加，厚壁菌門的相對(duì)豐度逐漸降低，螺旋菌門和纖維桿菌門的數(shù)量也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化，但不顯著[34]。本試驗(yàn)結(jié)果也出現(xiàn)了類似的變化趨勢(shì)。在屬水平上，本試驗(yàn)中的普雷沃氏菌屬_1 的相對(duì)豐度最高，與前人研究結(jié)果[35]一致。普雷沃氏菌屬_1 在各組間的差異不顯著，可能因?yàn)閷?duì)照組與試驗(yàn)組的飼糧粗蛋白質(zhì)和能量水平相近，沒(méi)有對(duì)普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度產(chǎn)生顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)理研菌科_RC9 菌屬含量隨著日糧纖維含量的降低，表達(dá)量降低[36]。理研菌科具有降解結(jié)構(gòu)性碳水化合物的作用[37]，酵母發(fā)酵飼料可增加理研菌科含量以提高纖維素的降解?？死锼闺鷮儆诤癖诰T，在維持胃腸道結(jié)構(gòu)、功能和動(dòng)物機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[38]。有研究認(rèn)為克里斯滕森菌的相對(duì)豐度隨著YC 添加水平的升高而降低，且與瘤胃pH 和NH3-N 含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明克里斯滕森菌屬與VFA 和NH3-N 的代謝相關(guān)[34]。本課題組前期試驗(yàn)表明，酵母發(fā)酵飼料可增加瘤胃中VFA，降低NH3-N 的濃度[9,39]。所以克里斯滕森菌屬_R-7 含量增加受到了酵母發(fā)酵飼料的正向影響，進(jìn)而改善了瘤胃的微環(huán)境。

16S rRNA 高通量測(cè)序結(jié)果最低到屬水平，需要結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的結(jié)果細(xì)化到種水平。在qPCR檢測(cè)中，隸屬于擬桿菌門的溶纖維丁酸弧菌、黃色瘤胃球菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、和隸屬于纖維桿菌門的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的變化趨勢(shì)與高通量測(cè)序結(jié)果保持一致。高通量測(cè)序結(jié)果顯示厚壁菌門在試驗(yàn)組中含量較低，而qPCR 檢測(cè)中埃氏巨型球菌在對(duì)照組中含量較低，二者結(jié)果不一致。在屬水平上，高通量測(cè)序結(jié)果中纖維桿菌屬和瘤胃球菌屬在對(duì)照組中的含量略高于試驗(yàn)組，與qPCR 檢測(cè)中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和黃色瘤胃球菌的結(jié)果不一致，可能原因?yàn)閝PCR 引物的特異性較高，而高通量測(cè)序中使用的是通用引物。此外，反芻獸甲烷短桿菌屬于古細(xì)菌中的廣古菌門，不屬于細(xì)菌。高通量測(cè)序中的細(xì)菌V3～V4 區(qū)通用引物未能涵蓋檢測(cè)，需要qPCR檢測(cè)來(lái)補(bǔ)充說(shuō)明。

近年來(lái)利用分子生物學(xué)方法研究反芻動(dòng)物瘤胃調(diào)控和微生物菌群之間互作關(guān)系雖有些許成果，但還需全面地深入了解和揭示。有國(guó)外的學(xué)者應(yīng)用計(jì)算硬件及配套的控制理論，設(shè)計(jì)了高性能微生物群落數(shù)據(jù)分析方法GPU-Meta-Storms，可實(shí)現(xiàn)在微秒的時(shí)間內(nèi)對(duì)微生物群落的環(huán)境樣本元基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，未來(lái)可能應(yīng)用于監(jiān)控瘤胃微生物的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化。另外，隨著完整基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)不斷擴(kuò)大，再加上環(huán)境特征數(shù)據(jù)的補(bǔ)充完善，可進(jìn)一步評(píng)估酵母發(fā)酵飼料對(duì)瘤胃微生物多樣性及其功能的影響[40]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，酵母發(fā)酵飼料可促進(jìn)纖維降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌、乳酸利用菌的生長(zhǎng)繁殖，降低產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量和瘤胃細(xì)菌的多樣性，改善瘤胃菌群結(jié)構(gòu)。