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        不同運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)小鼠睪酮分泌和精子生成的影響

        2021-03-01 11:34:40魏易焓盧靜怡王蕾蕾常成杰袁業(yè)現(xiàn)江青艷
        中國(guó)畜牧雜志 2021年2期
        關(guān)鍵詞:附睪睪酮雄性

        張 姹 ,魏易焓,盧靜怡,王蕾蕾,常成杰,徐 暢,袁業(yè)現(xiàn),尹 聰,束 剛*,江青艷

        (1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,廣東廣州 510642;2.廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642)

        雄性動(dòng)物的精子數(shù)量和活力是保證雌性動(dòng)物受胎率、產(chǎn)仔數(shù)和子代健康的重要前提[1]。在雄性生殖系統(tǒng)中,睪丸和附睪是重要的性腺器官[2]。睪丸主要由睪丸曲細(xì)精管和管外組織組成,曲細(xì)精管是精子生成的場(chǎng)所[3]。睪丸生成的精細(xì)胞不具備運(yùn)動(dòng)與受精的能力,需要在附睪中完成精子成熟相應(yīng)的形態(tài)變化和功能變化[4]。雄激素是維持性腺功能必不可少的激素[5]。

        除性腺激素外,雄性動(dòng)物生殖能力還受到營(yíng)養(yǎng)、應(yīng)激和運(yùn)動(dòng)等多種因素影響[6]。其中,運(yùn)動(dòng)是改善動(dòng)物生殖機(jī)能的有效方式之一。在畜牧生產(chǎn)中,通常需要給種公豬配備運(yùn)動(dòng)場(chǎng),滿足運(yùn)動(dòng)的需求,以保證精液品質(zhì)[7-8]。目前研究運(yùn)動(dòng)對(duì)生殖能力影響的研究模型多為肥胖且生殖能力受損的小鼠[9]。有研究表明,高脂誘導(dǎo)肥胖大鼠長(zhǎng)期負(fù)重游泳訓(xùn)練可顯著增加大鼠的精子總數(shù)、增加精子活動(dòng)率[10]。相反,間接性耐力會(huì)顯著增加肥胖大鼠的精子畸形率,降低精子總量[11]??梢姴煌倪\(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)小鼠生殖機(jī)能的影響不一,但目前鮮有關(guān)于運(yùn)動(dòng)對(duì)健康青年小鼠生殖能力影響的報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)主要研究力竭運(yùn)動(dòng)(Exhaustive Exercise,EE)、短期有氧運(yùn)動(dòng)(Acute Aerobic Exercise,AAE)和長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)(Chronic Aerobic Exercise,CAE)對(duì)健康青年雄性小鼠睪酮分泌和生殖的影響及其可能機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 不同運(yùn)動(dòng)模型小鼠的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)所用雄性的C57BL/6J 小鼠均購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(廣東佛山)。32 只11 周齡雄性小鼠按體重隨機(jī)分成4 組(n=8),分別是對(duì)照組(CON 組)、力竭運(yùn)動(dòng)組(EE 組)、短期有氧運(yùn)動(dòng)組(AAE 組)和長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)組(CAE 組)。EE組訓(xùn)練方法:在跑步機(jī)上以10 m/min 的速度跑10 min后休息10 min,休息結(jié)束以10 m/min 的速度每3 min 加2 m/min,加至20 m/min,以20 m/min 持續(xù)訓(xùn)練3 h,訓(xùn)練結(jié)束后迅速采樣。AAE 組訓(xùn)練方法:在跑步機(jī)上以10 m/min 的速度跑10 min 后休息10 min,休息結(jié)束在10 m/min 的速度基礎(chǔ)上以每3 min 加2 m/min,加至20 m/min,以20 m/min 的速度持續(xù)訓(xùn)練1 h,訓(xùn)練結(jié)束后迅速采樣。CAE 組訓(xùn)練方法:在跑步機(jī)上以10 m/min的速度跑10 min 后休息10 min,休息結(jié)束后在10 m/min的速度基礎(chǔ)上以每3 min 加2 m/min,加至20 m/min,以20 m/min 的速度持續(xù)訓(xùn)練1 h,每天按照上述方式重復(fù)訓(xùn)練,每訓(xùn)練5 d 休息2 d,訓(xùn)練2 周后停止訓(xùn)練,最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24 h 內(nèi)采樣[12]。

        1.2 性腺樣本的采集、HE 染色及統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠脫頸法處死,腹部涂抹75% 酒精,開腹后迅速采集一側(cè)完整睪丸和附睪置于4%的多聚甲醛中固定過夜,然后經(jīng)過乙醇溶液脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。HE 染色過程:經(jīng)二甲苯脫蠟,乙醇溶液脫水,蘇木精伊紅染色,二甲苯透明,中性樹膠封片。

        使用ImageJ 1.8.0 統(tǒng)計(jì)睪丸曲細(xì)精管空腔絕對(duì)面積。附睪尾每個(gè)樣品隨機(jī)選取10 個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)該視野不規(guī)則附睪管的比率,最后求均值。小鼠處死后迅速分離附睪,轉(zhuǎn)移至1 mL、37℃生理鹽水中,剪刀剪碎附睪,37℃孵育10 min 后,移液槍輕輕吹勻精子懸浮液后,用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定精子數(shù)量;將懸浮液均勻抹于玻片上風(fēng)干,甲醇固定5 min,伊紅染色1 h,蒸餾水浸洗。風(fēng)干后在400 倍光學(xué)顯微鏡模式下觀察2000 個(gè)精子細(xì)胞的形態(tài),統(tǒng)計(jì)精子畸形率。

        1.3 血清樣品檢測(cè) 采集小鼠全血,4℃、3000 r/min離心25 min,吸取上層血清-20℃保存?zhèn)溆?。血清睪酮水平的檢測(cè):采用Testosterone assey kit(USA,R&D system)檢測(cè)。

        1.4 睪丸樣本的采集及熒光定量PCR 檢測(cè) 小鼠處死后分別取出取完整睪丸置于液氮中速凍,然后將樣品轉(zhuǎn)移至冰箱中-80℃保存。提取睪丸組織總RNA,利用試劑 TRIzol,常規(guī)方法抽提,熒光定量PCR 檢測(cè)睪丸中睪酮合成代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因包括類固醇急性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Steroidogenic Acute Regulatory Protein,STAR)、3β-羥基類固醇脫氫酶異構(gòu)酶2(Hydroxy-Delta-5-Steroid Dehydrogenase,3 Beta-And Steroid,3β-HSD)、17β羥類固醇脫氫酶(Hydroxysteroid 17-Beta Dehydrogenase,17β-HSD)、類固醇5α-還原酶1(Steroid 5 Alpha-Reductase 1,SRD5A1)、類固醇5α-還原酶2(Steroid 5 Alpha-Reductase 2,SRD5A2)和細(xì)胞色素P450 膽固醇側(cè)鏈裂解酶(Cytochrome P450scc,P450scc)。以β-actin作為內(nèi)參,對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理?;诟髂康幕蚺c內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率接近,根據(jù)公式計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的比值來反映各基因的相對(duì)表達(dá)豐度:2-△△Ct=2-(Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因),其中Ct目的基因?yàn)槟康幕虻腃t 值,Ct內(nèi)參基因?yàn)閮?nèi)參基因的Ct 值。

        表1 熒光定量PCR 所用引物序列

        1.5 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05 表示顯著差異。

        2 結(jié)果

        2.1 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)雄性小鼠性腺重量及血清睪酮水平對(duì)比不同運(yùn)動(dòng)方式的結(jié)果發(fā)現(xiàn),EE 可顯著增加小鼠睪丸組織重量,AAE 和CAE 對(duì)小鼠睪丸和附睪的組織重量均無顯著影響(圖1-A),組織重量按照小鼠體重校正。與對(duì)照組相比,EE 可顯著降低小鼠血清睪酮水平,AAE 對(duì)小鼠血清睪酮無顯著影響,而CAE 可顯著上調(diào)小鼠血清睪酮(圖1-B)??梢姴煌\(yùn)動(dòng)方式可能通過影響睪酮分泌水平,調(diào)節(jié)雄性生殖能力。

        2.2 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)血清睪酮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響 圖2 表明,EE 可降低STAR mRNA 的表達(dá),AAE 對(duì)STAR 表達(dá)無顯著影響,而CAE 可上調(diào)STAR表達(dá)(P<0.05)。不同運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)睪丸3β-HSD、17β-HSD、SRD5A1、SRD5A2 的mRNA 表達(dá)均無顯著影響。由此提示,不同運(yùn)動(dòng)方式可能通過調(diào)控睪丸STAR mRNA 表達(dá),從而影響血清睪酮水平。

        圖1 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)雄性小鼠性腺重量和血清睪酮的影響(n=8)

        圖2 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠血清睪酮及睪丸睪酮合成代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響(n=8)

        2.3 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)的影響 如圖3所示,對(duì)照組、AAE 組和CAE 組睪丸組織曲細(xì)精管排列緊密,睪丸間質(zhì)無滲出;但EE 組曲細(xì)精管排列不緊密,間質(zhì)可見細(xì)胞滲出;而CAE 組曲細(xì)精管空腔面積顯著低于其他3 組,說明精子生成較多。

        2.4 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)雄性小鼠附睪發(fā)育的影響 如圖4所示,EE 組小鼠附睪管排列不緊密,附睪管形狀不規(guī)則,間質(zhì)可見滲出的精子。AAE 和CAE 組小鼠附睪管排列緊密,附睪管形狀規(guī)則,與對(duì)照組無明顯差異。提示EE 可損害附睪管管壁結(jié)構(gòu)。

        圖3 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)的影響(n=8)

        2.5 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)雄性小鼠精子品質(zhì)的影響 進(jìn)一步通過小鼠精子涂片HE 染色,發(fā)現(xiàn)EE 組精子總數(shù)雖無變化,但其畸形率顯著升高;相反,CAE 可顯著增加精子總數(shù),顯著降低精子畸形率(圖5)。AAE 對(duì)小鼠精子總數(shù)和精子畸形率均無顯著影響。

        圖4 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)雄性小鼠附睪發(fā)育的影響(n=8)

        圖5 不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)雄性小鼠精子品質(zhì)的影響(n=8)

        3 討 論

        運(yùn)動(dòng)可以調(diào)節(jié)雄性動(dòng)物生殖能力,也可以調(diào)控雄性動(dòng)物血清睪酮水平。有研究表明,運(yùn)動(dòng)可顯著增加公豬性腺器官指數(shù),顯著提高每次射精的精子總數(shù)[13]。長(zhǎng)期中等強(qiáng)度游泳可有效激活肥胖小鼠瘦素信號(hào)通路,增加其血清睪酮水平,但長(zhǎng)期高強(qiáng)度游泳反而抑制該信號(hào)通路,降低血清睪酮水平,降低精子質(zhì)量[14]。這些研究中運(yùn)動(dòng)對(duì)于雄性動(dòng)物生殖或睪酮水平的影響并不一致,原因可能與運(yùn)動(dòng)的時(shí)間和強(qiáng)度有關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn),僅一次性力竭運(yùn)動(dòng)可顯著降低小鼠血清睪酮水平,損傷精子品質(zhì),而CAE 則可顯著提高小鼠血清睪酮水平,提高精子品質(zhì)。目前對(duì)于高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)損傷雄性生殖系統(tǒng)的機(jī)制還不是非常清楚,推測(cè)可能與應(yīng)激激素、代謝物和局部炎癥水平有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可以增加肥胖小鼠的皮質(zhì)酮和乳酸的產(chǎn)生,從而降低睪酮的分泌,而中低強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)會(huì)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活,減少TNF-α轉(zhuǎn)錄表達(dá),改善精子質(zhì)量,提高雄性生殖能力[15]。上述結(jié)果說明,長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)雄性動(dòng)物生殖機(jī)能最為有利。所以在畜牧生產(chǎn)中可考慮采用長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)來改善種公豬繁殖性能。

        雄性動(dòng)物精子發(fā)育、成熟和品質(zhì)不僅受到性腺局部組織的微環(huán)境,如睪丸組織局部炎癥、附睪液pH 等影響,也受性激素、甲狀腺素等內(nèi)分泌激素影響[16]。其中,下丘腦-垂體-性腺軸對(duì)于精子發(fā)生和精子成熟過程是不可或缺的。摘除成年雄性大鼠垂體,大鼠精子發(fā)生過程受損,如補(bǔ)充睪酮可重新啟動(dòng)精子發(fā)生過程,而且促黃體素(Luteinizing Hormone,LH)、促卵泡素(Follicle-Stimulating Hormone,F(xiàn)SH)以及睪酮的協(xié)同作用對(duì)維持正常生精和生精再激活必不可少[17]。本研究發(fā)現(xiàn),不同的運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)于小鼠睪酮水平有不同的影響。其中,EE 可顯著降低血清睪酮水平,而CAE 可顯著提高小鼠睪酮水平。睪酮水平受多種代謝酶影響,睪酮的生成涉及多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和酶促反應(yīng),其中STAR和P450scc分別是睪酮合成過程中重要的運(yùn)載體和主要的限速酶[16]。STAR轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇至線粒體內(nèi)膜,在線粒體內(nèi)膜上的P450scc催化膽固醇裂解成為孕烯醇酮,后者由3β-HSD轉(zhuǎn)運(yùn)至滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),經(jīng)17β-HSD催化生成睪酮[18]。有研究報(bào)道,6 周間歇性游泳訓(xùn)練可顯著降低大鼠睪丸STAR的mRNA 水平[19]。本研究檢測(cè)不同運(yùn)動(dòng)后小鼠睪丸睪酮合成代謝轉(zhuǎn)運(yùn)酶相關(guān)基因發(fā)現(xiàn),EE 可顯著抑制睪丸STARmRNA 表達(dá),抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜,而CAE 可顯著上調(diào)睪丸STARmRNA 表達(dá),增加膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。由此可以推測(cè),STAR可能是運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)睪酮合成的關(guān)鍵靶點(diǎn),而運(yùn)動(dòng)對(duì)睪酮合成代謝酶酶活是否有影響還需進(jìn)一步研究。

        睪丸生成的精子需要在附睪中完成精子成熟相應(yīng)的形態(tài)變化和功能變化,包括原生質(zhì)滴移位、頂體形狀和大小的變化、精子頭尾結(jié)構(gòu)的固定等[19]。由此可知,附睪組織受損可導(dǎo)致精子畸形率的異常增加[20]。目前尚無運(yùn)動(dòng)如何直接通過調(diào)控附睪功能,從而影響精子成熟的研究報(bào)道。有研究表明,6 周有氧運(yùn)動(dòng)可增加高糖誘導(dǎo)肥胖小鼠附睪脫氫表雄酮的水平,同時(shí)改善大鼠的生殖功能[21]。脫氫表雄酮是作為睪酮來源的前體物質(zhì),但尚不清楚脫氫表雄酮是否介導(dǎo)了運(yùn)動(dòng)對(duì)附睪功能的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn),EE 嚴(yán)重?fù)p害小鼠附睪管管壁形態(tài),精子滲出至間質(zhì),降低睪酮水平,導(dǎo)致精子畸形率顯著增加;而CAE 組雖對(duì)附睪形態(tài)無明顯影響,但可以顯著升高睪酮水平,同時(shí)降低了精子的畸形率。不同運(yùn)動(dòng)方式和運(yùn)動(dòng)時(shí)間通過何種機(jī)制影響附睪功能和精子成熟還有待于進(jìn)一步深入研究。

        4 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可顯著促進(jìn)睪酮分泌和精子生成,同時(shí)降低精子畸形率,但急性力竭運(yùn)動(dòng)正好相反。短期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)雄性生殖無顯著影響。

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