劉曉昆 ，王立新

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

肝臟是調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡和解毒的主要器官，正是由于這些重要的作用，肝細胞極易受到藥物、化學(xué)和環(huán)境等因素的影響導(dǎo)致肝損傷。研究表明，氧化應(yīng)激是肝細胞損傷的病理學(xué)基礎(chǔ)。四氯化碳（CCL4）、亞硝胺以及環(huán)磷酰胺等肝毒性藥物可通過產(chǎn)生過量的活性氧（ROS）誘導(dǎo)肝細胞氧化應(yīng)激損傷[1]。

核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是調(diào)控含抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的主要轉(zhuǎn)錄因子，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種抗氧化和Ⅱ期解毒酶，如：血紅素氧合酶1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）及谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）[2-3]。通過外建立“Nrf2分級激活”小鼠模型，驗證了多種肝臟毒性物質(zhì)誘導(dǎo)小鼠肝損傷以及氧化應(yīng)激的程度與Nrf2的激活程度密切相關(guān)[4]。大量研究證實，激活Nrf2相關(guān)信號通路對于治療慢性肝病具有重要作用，鐵皮石斛[5]、右旋美托咪啶[6]均能通過激活Nrf2信號通路，保護肝細胞氧化損傷。

肝爽顆粒（GSG）是咸陽步長制藥有限公司基于中醫(yī)藥理論及多年臨床經(jīng)驗總結(jié)而成的中藥復(fù)方制劑，由醋制柴胡、白芍、當(dāng)歸、茯苓、炒白術(shù)、黨參、鱉甲、蒲公英、虎杖、炒枳殼、夏枯草、丹參和桃仁13味中藥組成，具有舒肝健脾、清熱散瘀、保肝護肝、軟堅散結(jié)的療效，臨床可用于治療肝炎、肝硬化及肝損傷等病癥[7]?；A(chǔ)研究表明，GSG能夠通過改善大鼠肝組織中蛋白質(zhì)多糖、膠原蛋白和非膠原性糖蛋白等含量，治療CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化[7]。GSG中的主要成分柚皮苷通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）從而抑制肝星狀細胞的活化，最終發(fā)揮抗肝纖維化的作用[8]。GSG能抑制CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠肝細胞凋亡，其機制與增強細胞自噬表達有關(guān)[9]。大量臨床研究也說明了GSG聯(lián)合其他藥物治療各種肝病療效顯著。GSG聯(lián)合多烯磷脂膽堿注射液治療慢性乙型肝炎具有較好的臨床療效[10]。慢性乙型肝炎肝纖維化患者經(jīng)過GSG聯(lián)合恩替卡韋治療后，肝功能有較大程度的改善，細胞外基質(zhì)代謝也明顯改善，癥狀也明顯好轉(zhuǎn)[11]。乙肝肝硬化患者接受GSG聯(lián)合恩替卡韋抗病毒治療，有利于改善患者的肝功能且有較好的耐受性[12-13]。乙型肝炎患者使用GSG聯(lián)合α干擾素治療，能提高機體的免疫力，提高患者病毒轉(zhuǎn)陰率[14]。但是GSG治療慢性肝損傷的研究較少，其機制也尚未明確。因此，本研究旨在通過腹腔注射CCL4建立慢性肝損傷小鼠模型，初步探討GSG對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠的保護作用及其潛在機制，為GSG治療慢性肝損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 GSG購自咸陽步長制藥有限公司；CCL4（純度≥99%）購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）微量蛋白檢測試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司；總核糖核酸（RNA）提取試劑盒、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑均購自天根生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 50只BALB/c小鼠[雄性，體質(zhì)量（20±2）g]購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：1100111911034967。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（22±2）℃，濕度50%±10%，光照明暗各12 h，動物自由攝食和飲水，每周更換兩次墊料。

1.3 實驗分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將50只BALB/c小鼠分為正常組（10只）和模型組（40只）。正常組腹腔注射橄欖油（2 mL/kg），模型組腹腔注射20% CCL4橄欖油溶液（2 mL/kg），每周 2次，持續(xù)6周[15]。成功造模后將40只模型小鼠分為模型組、GSG低劑量組、GSG中劑量組、GSG高劑量組。對照組與模型組灌胃生理鹽水，每日10 mL/kg，GSG低、中、高劑量組每日灌服GSG水溶液1、2、4 g/kg，連續(xù) 4 周[7-8]。

1.4 小鼠的一般情況及肝指數(shù) 造模給藥期間觀察小鼠的毛色及生活狀況，隔日稱量小鼠的體質(zhì)量。末次給藥后，小鼠禁食12 h，麻醉、稱量小鼠體質(zhì)量后脫頸處死小鼠，取各組小鼠的肝組織，于生理鹽水中清洗干凈后用濾紙充分吸干水分，稱質(zhì)量，計算小鼠的肝指數(shù)。肝指數(shù)（%）=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%[16]。

1.5 血清生化指標(biāo)檢測 目內(nèi)眥取血后，離心（3 500 r/min，15 min，離心半徑 15.9 cm）收集血清，試劑盒檢測各組小鼠血清中AST、ALT水平。

1.6 肝組織病理檢查 取各組小鼠的肝組織，4%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、包埋、切片等處理后，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織的病理學(xué)特征。

1.7 肝組織生化指標(biāo)檢測 稱取100 mg肝組織，加入900 μL預(yù)冷的生理鹽水（質(zhì)量體積比為1∶9），冰上勻漿制作10%的肝組織勻漿，離心（4 000 r/min，10 min，離心半徑15.9 cm），取上清BCA測定肝組織勻漿中蛋白含量、SOD、GSH-Px和MDA水平。

1.8 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測 造模給藥后，取各組小鼠的肝組織，提取肝組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，試劑盒擴增，qPCR法檢測小鼠肝臟組織中 Nrf2、HO-1、GCLC和 NQO1的mRNA相對表達水平，GAPDH為內(nèi)參。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSG對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠的治療作用 通過計算各組小鼠的肝指數(shù)，筆者發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝指數(shù)與正常組相比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，GSG低劑量組肝指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但GSG中、高劑量組肝指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血清AST和ALT活性均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01），說明模型組小鼠肝損傷明顯；與模型組比較，GSG低劑量組AST與ALT水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而GSG中、高AST和ALT活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01），說明 GSG 能顯著改善CCL4所誘導(dǎo)的肝損傷。見表2。

表2 GSG對慢性肝損傷小鼠肝指數(shù)、AST、ALT的影響（±s）

表2 GSG對慢性肝損傷小鼠肝指數(shù)、AST、ALT的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) 肝指數(shù)（%） AST（U/L） ALT（U/L）正常組 10 4.52±0.22 73.05±8.87 32.32±4.26模型組 10 6.29±0.46** 152.96±16.81** 69.63±27.45*GSG 低劑量組 10 5.92±0.44 137.92±43.52 47.06±10.79 GSG 中劑量組 10 5.77±0.19# 101.21±18.47## 39.20±5.63#GSG 高劑量組 10 5.66±0.53# 56.37±15.55## 34.72±11.78#

造模后，觀察各組小鼠肝組織HE染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞核清晰，胞質(zhì)完整。模型組小鼠肝組織有廣泛的組織學(xué)改變，表現(xiàn)為肝細胞嚴(yán)重水腫呈氣泡樣變，肝細胞核碎裂壞死，肝索解離。GSG低劑量組肝細胞嚴(yán)重水腫，而GSG中、高劑量組肝細胞水腫與壞死情況較模型組減輕，說明GSG能減輕肝損傷程度。見圖1。

圖1 小鼠肝組織HE染色（×200）

2.2 GSG對慢性肝損傷小鼠肝組織氧化損傷的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），說明CCL4誘導(dǎo)慢性肝損傷模型小鼠的肝組織氧化損傷明顯。與模型組比較，GSG低、中、高劑量組能明顯升高肝組織中SOD和GSH-Px活性（P＜0.05或 P＜0.01），降低 MDA 含量（P＜0.05或P＜0.01）。見表 3。

表3 GSG對慢性肝損傷小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影響（±s）

表3 GSG對慢性肝損傷小鼠SOD、GSH-Px及MDA的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù) SOD（U/mgprot）GSH-Px（U/mgprot）MDA（nmol/mgprot）正常組 10 318.67±6.44 366.65±17.27 19.66±1.58模型組 10 232.41±5.06* 295.11±12.20* 29.36±3.28*GSG 低劑量組 10 242.13±2.84## 278.77±22.38 24.30±3.67#GSG 中劑量組 10 249.43±7.99## 317.53±19.31# 24.53±2.67#GSG 高劑量組 10 304.61±15.28## 341.13±19.46## 19.60±1.74##

2.3 GSG對慢性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響 為了探究GSG是否通過調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化作用，課題組檢測了各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、GCLC和 NQO1基因的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠Nrf2、HO-1、Gclc和NQO1的mRNA表達明顯下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，除GSG低劑量組HO-1 mRNA和GSG中劑量組GCLC mRNA表達水平無統(tǒng)計學(xué)意義外，其余GSG低、中、高劑量組Nrf2、HO-1、Gclc和 NQO1的表達均上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。見圖 2。

圖2 造模給藥后各組小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、GCLC和 NQO1 mRNA 相對表達量（±s，n=6）

3 討論

研究表明，P450酶系統(tǒng)代謝CCl4產(chǎn)生代謝產(chǎn)物三氯甲基自由基與三氯甲基過氧自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化，ROS過量產(chǎn)生引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝細胞損傷[17]。ALT和AST是催化氨基酸和酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的酶，主要存在于肝細胞中。肝細胞受損或凋亡時會釋放AST和ALT入血，因此，血清AST、ALT水平能反映肝功能受損的情況和程度[16]。本研究采用CCL4建立慢性肝損傷模型小鼠發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清中AST和ALT水平與正常組相比均顯著升高，并且HE染色結(jié)果顯示肝細胞大量水腫、部分肝細胞壞死，說明本研究造模成功。本研究發(fā)現(xiàn)GSG各劑量組能降低CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠血清中AST、ALT活性并一定程度上緩解肝細胞水腫和壞死，說明GSG對CCL4所誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠有一定的保護作用。

SOD是機體對抗氧化應(yīng)激的第一道防線，是清除體內(nèi)超氧陰離子的專一性抗氧化酶，能催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H2O2）和氧氣（O2）[18-19]。GSH是一種內(nèi)源性抗氧化劑，可以催化過氧化物還原，保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷[19-20]。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物。因此，檢測肝組織中SOD、GSH-Px和MDA的活性，能一定程度反映肝臟氧化損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA水平顯著升高。而給予GSG灌胃處理后，肝組織中SOD、GSH-Px活性又顯著升高，同時MDA水平明顯下降，表明GSG對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠肝組織的氧化損傷有一定保護作用。

氧化應(yīng)激是肝損傷發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，因此，調(diào)節(jié)肝臟氧化應(yīng)激是治療肝臟疾病的重要途徑。Nrf2是一種氧化應(yīng)激介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)多種細胞，包括肝細胞的氧化應(yīng)激損傷[21]。正常情況下，Nrf2與負調(diào)節(jié)因子kelch樣的ech相關(guān)蛋白1（Keap1）在細胞質(zhì)中形成復(fù)合體，而在氧化應(yīng)激情況下，Nrf2磷酸化并從Nrf2-Keap1復(fù)合體中解離，轉(zhuǎn)位進入細胞核中，誘導(dǎo)HO-1、NQO1、GCLC等下游基因釋放，發(fā)揮抗氧化作用，從而保護肝細胞[22]。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，能催化血紅素氧化降解為膽綠素，膽綠素隨后被膽紅素還原酶轉(zhuǎn)化為膽紅素，膽紅素具有抗補體作用，可保護細胞免受補體激活介導(dǎo)的炎癥和氧化損傷反應(yīng)[23-24]。GCLC是肝臟中生物合成的限速酶[25]。NQO1具有清除超氧化物的能力，能夠保護肝細胞不受氧化應(yīng)激損傷[19]。本研究檢測Nrf2及其關(guān)鍵抗氧化酶顯示，GSG能激活Nrf2、HO-1及其下游GCLC和 NQO1的mRNA表達從而發(fā)揮抗氧化作用，提示GSG可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解慢性肝損傷模型小鼠的氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究結(jié)果說明了GSG能激活Nrf2、HO-1、NQO1及GCLC，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提示GSG可能是通過激活Nrf2/HO-1信號通路緩解CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠的肝功能受損，為臨床GSG治療慢性肝損傷提供了理論依據(jù)。