劉進(jìn)，周杰，李王文，陳永平，王敬

隨著人口老齡化的不斷加劇，腦血管病患病人數(shù)日益增多，已成為全球第二大死亡原因，血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCI)的患病人群也在不斷增多[1]。VCI是指由腦血管病或腦血管病危險(xiǎn)因素引起的從輕度認(rèn)知功能障礙到癡呆的一大類綜合征，其中腦血管病包括腦梗死、腦出血、慢性腦缺血或腦白質(zhì)疏松等[2]。VCI不同于阿爾茨海默病、額顳葉癡呆等一系列神經(jīng)變性病所引起的認(rèn)知功能障礙，VCI具有可預(yù)防、延緩，甚至逆轉(zhuǎn)認(rèn)知損害進(jìn)程的特點(diǎn)[3]。銀杏葉提取物EGb761對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，EGb761包括24%黃酮、6%內(nèi)脂和其他微量元素，如花青素和有機(jī)酸[4]。EGb761的主要作用：改善認(rèn)知功能及血液循環(huán)、提高組織代謝功能、對(duì)抗缺血不利影響[5]。EGb761通過其清除氧自由基、抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的膜損傷，從而恢復(fù)大腦皮質(zhì)和海馬中受體的減少，進(jìn)而改善認(rèn)知功能[6]?，F(xiàn)觀察不同劑量銀杏葉提取物EGb761對(duì)VCI模型大鼠的作用及其機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物及分組：清潔級(jí)SD大鼠120只[由重慶藥友制藥有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SYXK(渝)2017-0013]，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組30只。(2)藥物及試劑：銀杏葉提取物EGb761(德國威瑪舒培博士藥廠)；5羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、多巴胺(DA)ELISA 檢測試劑盒均購自美國 R&D公司。(3)儀器: Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)，紫外/可見分光光度計(jì)(Perkin Elmer公司)，可調(diào)高速勻漿器FSH-2(常州國華電器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立VCI模型： 2019年3—6月在重慶三峽中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 采取雙血管結(jié)扎(2VO)改良法[7]建立大鼠VCI動(dòng)物模型。以3.0%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，頸部正中備皮并消毒后切開表層皮膚，切口約2 cm，鈍性分離肌肉及筋膜，充分暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈，用手術(shù)線在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和近心端分別雙結(jié)扎，而假手術(shù)組不結(jié)扎雙側(cè)頸動(dòng)脈；手術(shù)完成后縫合皮膚，并回籠飼養(yǎng)。以假手術(shù)組大鼠游到平臺(tái)所需時(shí)間的95%上限值作為標(biāo)準(zhǔn)，綜合大鼠的一般情況評(píng)價(jià)模型。

1.2.2 給藥方法：4組大鼠VCI手術(shù)造模后第2天開始灌胃給藥，低劑量組給予銀杏葉提取物EGb761生理鹽水混懸液50 mg/kg，高劑量組給予100 mg/kg，假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水，4組均每天1次， 連續(xù)給藥60 d。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)：水迷宮是由直徑120 cm的白色圓形水槽和直徑12 cm圓形平臺(tái)組成，平臺(tái)置于水槽中，向水槽中灌水并漫過平臺(tái)2 cm。水迷宮分4個(gè)象限，在實(shí)驗(yàn)開始前，從1、2、4象限中隨機(jī)選擇一個(gè)象限邊緣的1/2處將大鼠頭朝向水池壁放入水中，從大鼠連續(xù)給藥的第56天開始測試5 d，觀察SD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，大鼠在水中自由游泳時(shí)間<2 min，若大鼠在2 min內(nèi)找到圓形平臺(tái)并停留5 s，則記錄下所用時(shí)間;在2 min內(nèi)，若大鼠沒有找到平臺(tái)，則記錄逃避潛伏期為2 min。計(jì)算3個(gè)象限的逃避潛伏期的平均值作為當(dāng)天大鼠的逃避潛伏期。

1.3.2 Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn):水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開始空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去位于第3象限的平臺(tái)，做好標(biāo)記后，同時(shí)隱蔽第3象限的原有逃生平臺(tái)位置，大鼠入水點(diǎn)為第1象限1/2處(平臺(tái)象限的對(duì)角處)，其余步驟與定向航行實(shí)驗(yàn)一致。記錄2 min內(nèi)各組大鼠穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)、平臺(tái)停留時(shí)間、有效區(qū)停留時(shí)間等。

1.3.3 大鼠腦神經(jīng)標(biāo)志物檢測： 干預(yù)第15、30、60天水迷宮測試結(jié)束后，各組隨取大鼠10只立即斷頭處死取腦，除去腦膜和小腦組織，保留大腦部分；用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，勻漿，加適量水制成10%腦組織勻漿，于-4℃低溫離心取適量上清液，使用ELISA試劑盒檢測AchE、DA、NE、5-HT水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮定向航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較 整體比較(兩因素重復(fù)測量方差分析)：各指標(biāo)組間差異、時(shí)間差異及交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩精細(xì)比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：模型組第56～58天的逃避潛伏期長于假手術(shù)組，但高劑量組逃避潛伏期短于模型組、低劑量組(P<0.05)，模型組、低劑量組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第60天假手術(shù)組逃避潛伏期短于模型組，且高劑量組<低劑量組<模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

2.2 各組大鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)行為的變化比較 整體比較(單因素方差分析)：60天各指標(biāo)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠平臺(tái)停留時(shí)間、有效區(qū)停留時(shí)間、穿過平臺(tái)所在位置次數(shù)均縮短(P<0.05)，與模型組比較，高劑量組各指標(biāo)均增大(P<0.05)，而低劑量組無明顯變化(P>0.05)；與低劑量組比較，高劑量組各指標(biāo)均升高 (P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)行為變化比較

2.3 各組大鼠腦組織中AchE、DA、NE、5-HT水平比較 整體比較(兩因素重復(fù)測量方差分析)：各指標(biāo)組間差異、時(shí)間差異及交互作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩精細(xì)比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：第60天，模型組AchE水平高于假手術(shù)組，DA、NE、5-HT水平低于假手術(shù)組(P<0.05)；低劑量組DA水平高于模型組，高劑量組AchE水平低于模型組，DA、NE、5-HT水平高于模型組，且高劑量組AchE水平低于低劑量組(P<0.05)；低劑量組、高劑量組第60天AchE水平均低于第15、30天，DA、NE、5-HT水平均高于第15、30天(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腦組織中AchE、DA、NE、5-HT水平比較

3 討 論

截至2010年，全世界認(rèn)知功能障礙患病人數(shù)為3 560萬，預(yù)計(jì)2030年將增加至6 570萬，到2050年將增加至1.154億[8]。認(rèn)知功能障礙無法完全治愈，且有效預(yù)防措施也較少，VCI是目前所有認(rèn)知功能障礙疾病中唯一可干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)的認(rèn)知障礙類型[9-10]。銀杏葉提取物EGb761的臨床藥理作用較為復(fù)雜，具有改善線粒體功能和能量代謝、促進(jìn)海馬神經(jīng)元分化、提高神經(jīng)元可塑性、降低血液黏度、增強(qiáng)腦血流量等特點(diǎn)[11-12]。銀杏葉提取物EGb761含有內(nèi)脂和黃酮，相關(guān)研究表明，黃酮類物質(zhì)可以抑制認(rèn)知功能障礙等神經(jīng)變性病的病理學(xué)改變，甚至逆轉(zhuǎn)這一病理學(xué)改變[13]。因此，銀杏葉提取物EGb761的藥理效果能夠使其成為改善認(rèn)知功能的藥物之一，根據(jù)一項(xiàng)銀杏葉提取物EGb761的Meta分析表明，它能夠延緩非癡呆患者認(rèn)知功能減退的速度，并改善癡呆患者的認(rèn)知功能[14]。

有研究表明，銀杏葉提取物EGb761有助于改善認(rèn)知功能障礙患者的認(rèn)知功能及臨床總體評(píng)估[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，VCI大鼠經(jīng)過60天銀杏葉提取物EGb761干預(yù)后，高劑量組的逃避潛伏期、平臺(tái)停留時(shí)間、有效區(qū)停留時(shí)間、穿過平臺(tái)所在位置次數(shù)與假手術(shù)組比較無差異，表明高劑量銀杏葉提取物EGb761(100 mg/kg)對(duì)認(rèn)知功能有明顯的改善作用，能夠使VCI大鼠的記憶能力逐漸恢復(fù)正常水平。而低劑量組的逃避潛伏期短于模型組，且有效區(qū)停留時(shí)間、穿過平臺(tái)所在位置次數(shù)均多于模型組，但仍與假手術(shù)組有差異，表明低劑量銀杏葉提取物EGb761(50 mg/kg)能夠一定程度上改善大鼠的認(rèn)知功能，但并不能使大鼠的認(rèn)知功能達(dá)到完全正常水平，這提示增加銀杏葉提取物EGb761的劑量可增強(qiáng)其對(duì)VCI的認(rèn)知改善作用，這與既往研究中發(fā)現(xiàn)高劑量銀杏葉提取物可更好地改善血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能相符，但本研究逃避潛伏期更長，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯更少，推測可能是與該研究在建模前即注射銀杏葉提取物有關(guān)[16]。

認(rèn)知功能障礙病變的病理基礎(chǔ)與神經(jīng)遞質(zhì)水平的改變密切關(guān)系，與VCI關(guān)系較為密切的神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿、單胺類、氨基酸類及神經(jīng)肽類等，這些神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)多個(gè)認(rèn)知域起重要作用[17-18]。膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的破壞是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙和認(rèn)知功能減退的主要因素，本研究中建模后第15 d模型組、低劑量組、高劑量組的DA、NE、5-HT水平均低于假手術(shù)組，AchE水平高于假手術(shù)組，這與既往研究的結(jié)果相吻合，即在VCI進(jìn)展期神經(jīng)遞質(zhì)水平降低，且大腦皮質(zhì)、海馬等處的神經(jīng)活動(dòng)減少，神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE、5-HT水平降低，而發(fā)生VCI后，乙酰膽堿的大量水解需要分泌更多的AchE，繼而導(dǎo)致AchE水平升高[19-21]。在VCI的發(fā)病機(jī)制中，這些神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮關(guān)鍵性作用，并且各種神經(jīng)遞質(zhì)之間相互關(guān)系較為密切，其中乙酰膽堿與學(xué)習(xí)、記憶等多種認(rèn)知功能相關(guān)，而AchE大量分泌則意味著乙酰膽堿大量分解，進(jìn)而造成膽堿神經(jīng)元損傷，膽堿能神經(jīng)元的損傷是認(rèn)知功能障礙相關(guān)疾病的關(guān)鍵病理改變，因此AchE的升高提示認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[22]。DA遞質(zhì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的尾狀核、殼核、黑質(zhì)、蒼白球等處含量最高，其參與的黑質(zhì)—紋狀體系統(tǒng)、中腦邊緣系統(tǒng)是所有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)和精神認(rèn)知活動(dòng)的基礎(chǔ)[23]。NE遞質(zhì)主要由交感節(jié)后神經(jīng)元及腦內(nèi)的腎上腺素能神經(jīng)末梢合成、分泌，研究發(fā)現(xiàn)NE在執(zhí)行功能中具有重要的作用[24]。5-HT遞質(zhì)對(duì)大腦皮質(zhì)中突觸形成和維持有重要促進(jìn)作用，影響學(xué)習(xí)記憶、睡眠覺醒、體溫調(diào)節(jié)、攝食等多種活動(dòng)，在與額葉有關(guān)的認(rèn)知功能中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量銀杏葉提取物EGb761(100 mg/kg)能夠降低VCI大鼠腦組織中AchE活性，從而增強(qiáng)信號(hào)傳遞，改善大腦記憶力，提高VCI的認(rèn)知功能。并且發(fā)現(xiàn)高劑量銀杏葉提取物EGb761(100 mg/kg)能同時(shí)增加腦組織中DA、NE、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)的水平，且隨著干預(yù)時(shí)間的延長，腦組織中AchE水平逐漸降低，DA、NE、5-HT水平逐漸升高。這一研究發(fā)現(xiàn)表明，高劑量銀杏葉提取物EGb761能夠隨著干預(yù)時(shí)間的延長，逐漸增加DA、NE、5-HT等多種神經(jīng)遞質(zhì)水平，降低AchE水平，進(jìn)而改善VCI的認(rèn)知功能。

綜上所述，銀杏葉提取物EGb761能夠改善VCI大鼠的認(rèn)知功能，提高記憶能力，發(fā)揮延緩和逆轉(zhuǎn)VCI的作用，且100 mg/kg銀杏葉提取物EGb761作用效果優(yōu)于50 mg/kg，其作用機(jī)制可能是通過影響多種神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉進(jìn)：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫周杰、李王文：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改;陳永平：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；王敬：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核