劉偉,董耀,苗江雨,馬建亭

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素和多步驟的復(fù)雜過程，遺傳、飲食習(xí)慣和環(huán)境等多方面因素參與，預(yù)后不良[1]。CRC發(fā)病早期臨床表現(xiàn)不明顯，部分患者僅出現(xiàn)消化不良、大便潛血及腹部不適感等，易被忽略。若患者出現(xiàn)腹部包塊、腹痛、便血等明顯癥狀，大部分為進(jìn)展期，對(duì)患者的身體造成嚴(yán)重的傷害。因此，了解CRC發(fā)生發(fā)展及侵襲和轉(zhuǎn)移的規(guī)律，尋找特異性分子靶點(diǎn)及靶向藥物，改善預(yù)后，以及降低CRC發(fā)病率和病死率具有重要價(jià)值[2]。鈣結(jié)合蛋白A4 (S100A4) 屬于鈣離子結(jié)合蛋白(S100)家族，其在多種腫瘤如骨肉瘤、胃癌、腎癌、乳腺癌及肺癌等中過表達(dá)，且與患者不良預(yù)后關(guān)系緊密[3-4]，但目前關(guān)于CRC與S100A4研究甚少?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一， 其在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[5-6]?，F(xiàn)分析S100A4和MMP-2表達(dá)與CRC患者臨床/病理特征和預(yù)后關(guān)系，旨在為臨床診斷、治療及判斷患者預(yù)后提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年5月—2019年5月石家莊市第三醫(yī)院普外科行結(jié)直腸癌根治術(shù)后患者152例，取其保存的石蠟標(biāo)本作為研究對(duì)象(觀察組)，其中男81例(53.3%)，女71例(46.7%)，年齡52.8～65.6(59.8±5.5)歲；病變部位：結(jié)腸85例(55.9%)，直腸67例(44.1%)；組織學(xué)類型：乳頭狀腺癌62例(40.8%)，管狀腺癌44例(28.9%)，黏液腺癌46例(30.3%)；分化程度：高分化30例(19.8%)，中分化87例(57.2%)，低分化35例(23.0%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例(41.4%)。以距腫瘤>5 cm的癌旁正常結(jié)直腸黏膜組織的石蠟標(biāo)本50例作為對(duì)照組。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.1 組織中S100A4和MMP-2蛋白表達(dá)檢測(cè)：病變組織脫蠟與水化之后，于室溫下孵育、漂洗、甩干等過程，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，時(shí)間約2 min，鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍(lán)，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，采用已知陽(yáng)性片(天津市津脈基因測(cè)繪技術(shù)有限公司)作為陽(yáng)性對(duì)照。嚴(yán)格依據(jù)S-P免疫組織化學(xué)染色試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)說明書標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。

結(jié)果判定：S100A4蛋白和MMP-2蛋白均在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，于400倍顯微鏡(奧林巴斯CX23)下觀察。 每張切片隨機(jī)選10個(gè)高倍視野，觀察陽(yáng)性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[7-8]：(1)陽(yáng)性細(xì)胞百分率評(píng)分：未見陽(yáng)性細(xì)胞記0分，陽(yáng)性細(xì)胞<25%記1分，陽(yáng)性細(xì)胞25%～75%記2分，陽(yáng)性細(xì)胞>75%記3分。(2)顯色評(píng)分：細(xì)胞胞質(zhì)不顯色或者顯色不清記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。陽(yáng)性評(píng)定結(jié)果為上述2項(xiàng)評(píng)分相加：陰性(-)0～1分，弱陽(yáng)性(+)2～3分，中度陽(yáng)性(++)4～5分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)>5分。

1.2.2 血清CEA、CA199檢測(cè)：術(shù)前1周采集患者靜脈血2～5 ml，離心分離血清，以 UniCel DxI800全自動(dòng)免疫分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA和CA199水平。

2 結(jié) 果

2.1 2組組織中S100A4、MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 觀察組 S100A4和MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為61.8%、84.9%，顯著高于對(duì)照組的0、18.0%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=57.834/<0.001、77.723/<0.001)，見圖1。

2.2 2組血清CEA、CA199水平比較 觀察組血清CEA、CA199水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見表1。

表1 2組血清CEA、CA199水平比較

2.3 不同臨床/病理特征中S100A4、MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較 S100A4、MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在不同性別、年齡、部位、臨床分型、臨床分期、組織學(xué)類型患者中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而二者在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，分化程度中低分化患者高于高分化患者(P均<0.01)，見表2。

表2 S100A4、MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在不同臨床/病理特征中比較 [例(%)]

2.4 不同S100A4和MMP-2蛋白表達(dá)的CRC患者生存率比較 所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020年4月25日， S100A4、 MMP-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的CRC患者5年生存率分別為51.1%、55.8%，陰性表達(dá)患者5年生存率分別為77.6%、78.3%，S100A4、MMP-2陽(yáng)性表達(dá)者5年生存率顯著低于陰性表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2/P=10.624/0.046、4.072/0.037)，見圖2。

圖2 不同S100A4、MMP-2蛋白表達(dá)結(jié)直腸癌患者生存曲線

3 討 論

S100A4屬于鈣離子結(jié)合蛋白家族成員，被認(rèn)為是鈣傳感器蛋白的一類，是由腫瘤細(xì)胞和腫瘤活化的間質(zhì)細(xì)胞分泌的活性腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子[9-12]。已有文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)S100A4蛋白與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的相關(guān)研究。有學(xué)者利用免疫組化技術(shù)對(duì)180例結(jié)直腸癌組織中的S100A4蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),其結(jié)果為16%高表達(dá), 31%低表達(dá), 53%無表達(dá), 并且S100A4蛋白的表達(dá)是判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立影響因子(P<0.01)[13]。 另有研究者利用免疫組化技術(shù)對(duì)124例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行病理檢查，并進(jìn)行染色分析操作,結(jié)果表明，S100A4蛋白在正常結(jié)直腸黏膜上皮中無表達(dá)或弱表達(dá)；在結(jié)直腸癌組織中70例(56.5%)呈陽(yáng)性表達(dá), 43例(34.7%)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示S100A4蛋白的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但與腫瘤的位置和大小無關(guān)[14]。研究表明，S100A4蛋白表達(dá)與患者的臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，利用對(duì)S100A4蛋白表達(dá)狀態(tài)的檢測(cè)，可以輔助判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后[15]。

S100A4蛋白的高表達(dá)和結(jié)直腸癌 Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期具有極為緊密的聯(lián)系。本結(jié)果顯示，S100A4蛋白與結(jié)直腸癌的組織分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者的預(yù)后水平及效果等呈負(fù)相關(guān)。其主要原因可能為：S100A4能夠較大程度減少腫瘤細(xì)胞之間存在的黏附力。根據(jù)相關(guān)研究可知，上皮鈣黏蛋白屬于一種重要的細(xì)胞黏附分子，有效且適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)患者體內(nèi)的鈣離子依賴性細(xì)胞黏附力，進(jìn)一步對(duì)人體正常細(xì)胞間的黏附性進(jìn)行有效的維持[16-21]。有研究表明，S100A4蛋白和上皮鈣黏蛋白的表達(dá)之間始終呈負(fù)相關(guān)[22]。腫瘤組織中存在大量的S100A4蛋白表達(dá)，從而造成患者機(jī)體內(nèi)上皮鈣黏蛋白的表達(dá)處于持續(xù)降低狀態(tài)，最終加快了腫瘤細(xì)胞在腫瘤部位的脫落進(jìn)程。S100A4在結(jié)直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制及作用途徑尚不清楚[23-25]。本結(jié)果顯示，觀察組S100A4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者S100A4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，中分化和低分化S100A4蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于高分化，提示S100A4蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且隨著病情的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移表達(dá)逐漸升高；S100A4陽(yáng)性表達(dá)患者5年生存率低于陰性表達(dá)患者，提示S100A4陽(yáng)性表達(dá)越高預(yù)后越差。上述結(jié)果均顯示，在發(fā)生細(xì)胞癌變后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的S100A4蛋白。分期越晚，或發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌分泌S100A4蛋白的水平就越高，說明S100A4蛋白在結(jié)直腸癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程有著重要的作用。

研究表明，S100A4蛋白能夠有效地將細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解及重構(gòu),進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞移行,為惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移創(chuàng)造適宜條件,同時(shí)S100A4蛋白與MMP-2表達(dá)具有比較密切的關(guān)系；S100A4利用對(duì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-2)的改變和黏附于細(xì)胞膜上的膜型基質(zhì)蛋白酶1(MT1-MMP)進(jìn)行有效結(jié)合，從而促進(jìn)MMP-2酶原被激活[26]。另外研究表明, S100A4可激活NF-κB通路、促進(jìn)MMP-2的合成。

綜上所述，S100A4和MMP-2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯高于正常結(jié)直腸黏膜組織，且隨著結(jié)直腸癌病情發(fā)展表達(dá)升高，陽(yáng)性表達(dá)越高預(yù)后越差，可作為判斷結(jié)直腸癌患者病情和預(yù)后的指標(biāo)，為進(jìn)一步的研究及臨床治療提供了可靠的病理學(xué)依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉偉：課題設(shè)計(jì)和實(shí)施，分析、解釋數(shù)據(jù)，文章撰寫，統(tǒng)計(jì)分析；董耀：課題設(shè)計(jì)，文章修改，技術(shù)或材料支持；苗江雨：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；馬建亭：選題思路，課題設(shè)計(jì)，文章審閱、指導(dǎo)