楊電增，鄒蘭蘭，錢(qián)志偉

（河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 鄭州 451450）

馬齒莧（Portulaca oleraceaL.）又名五行草、麻繩菜、長(zhǎng)命菜，為馬齒莧科馬齒莧樹(shù)屬1 年生野生肉質(zhì)草本植物，在我國(guó)資源儲(chǔ)備極其豐富，被衛(wèi)生部列入既是食品又是藥品的物品名單目錄[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，馬齒莧中含有豐富的多糖、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、香豆素類(lèi)、萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)物質(zhì)等多種生物活性成分。馬齒莧多糖（Portulaca oleraceapolysaccharides）是其主要活性成分之一，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖和阿拉伯糖組成[2]，具有抑菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、降血糖、調(diào)血脂、抗衰老、保護(hù)心血管等生理功能[3-10]。因此，有效提取馬齒莧多糖對(duì)馬齒莧的綜合利用具有重要意義。

目前報(bào)道的馬齒莧多糖的提取工藝主要有溶劑提取、超聲波提取、微波提取、酶水解、高壓脈沖提取以及超高壓提取等方法[11-15]。而就酶法提取來(lái)說(shuō)，其關(guān)鍵是依靠果膠酶及纖維素酶對(duì)植物的細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)中的果膠還有纖維素等物質(zhì)進(jìn)行水解，進(jìn)一步提高活性成分的溶解速度，同時(shí)增強(qiáng)其溶解的效率。陳凌等[1]和錢(qián)志偉等[16]分別對(duì)果膠酶和纖維素酶提取馬齒莧多糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化，然而，雙酶法在馬齒莧多糖提取中的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究以馬齒莧為原料，使用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，探究纖維素酶和果膠酶的加入量、酶解溫度、酶解時(shí)間以及液料比對(duì)多糖得率的影響，在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化雙酶法提取馬齒莧多糖的最佳工藝參數(shù)，并測(cè)定其體外抗氧化活性，為馬齒莧資源的高效利用開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

馬齒莧（盛花期），于2020 年7 月下旬采摘于河南省農(nóng)業(yè)高新科技園。置于60 ℃恒溫箱烘24 h，破壁機(jī)粉碎后過(guò)60 目篩，加入乙醚進(jìn)行脫脂處理，備用。

1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH,純度99%），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；果膠酶（60 000 U/g）、纖維素酶（50 000 U/g），浙江一諾生物科技有限公司產(chǎn)品；雙氧水、硫酸亞鐵等為分析純，國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV1901PCS 型雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；D5-R2 型離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；BSA423S-CW 型分析天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海喬躍電子科技有限公司；L18-YJ08 型靜音真空破壁機(jī)，杭州生活電器有限公司；WGL-230B 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧多糖的雙酶法提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取馬齒莧粉末2.000 0 g，放入錐形瓶中，加入20 mL 超純水，加入纖維素酶和果膠酶，并在pH 5.0條件下進(jìn)行酶水解，酶水解后按一定料液比加入超純水，最后于75 ℃的水浴中提取4 h。將提取液以4 000 r/min 的速度離心15 min，取上清液進(jìn)行減壓蒸餾，最終用超純水定容至50 mL。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 纖維素酶添加量的篩選

選擇果膠酶添加量1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間120 min，液料比25∶1（mL/g），設(shè)置相對(duì)馬齒莧質(zhì)量的纖維素酶添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察纖維素酶添加量對(duì)馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.2 果膠酶添加量的篩選

選擇纖維素酶添加量2.0%，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間120 min，液料比25∶1（mL/g），設(shè)置相對(duì)馬齒莧質(zhì)量的果膠酶添加量分別為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，考察果膠酶添加量對(duì)馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.3 酶解時(shí)間的篩選

選擇相對(duì)馬齒莧質(zhì)量的纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、1.2%，酶解溫度45 ℃，液料比25∶1（mL/g），設(shè)置酶解時(shí)間分別為20、40、60、80、100、120 min，考察酶解時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.4 酶解溫度的篩選

選擇相對(duì)馬齒莧質(zhì)量的纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、1.2%，酶解時(shí)間120 min，液料比25∶1（mL/g），設(shè)置酶解溫度分別為25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對(duì)馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.5 液料比的篩選

選擇相對(duì)馬齒莧質(zhì)量的纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間120 min，設(shè)置液料比分別為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g），考察液料比對(duì)馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度為主要影響因素，以馬齒莧多糖得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，考察各因素對(duì)馬齒莧多糖得率的影響，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.2.4 馬齒莧多糖得率的測(cè)定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取20 mg 干燥至恒重的葡萄糖，用超純水溶解定容至100 mL，并對(duì)其進(jìn)行搖勻，配成0.2 mg/mL的多糖儲(chǔ)備液，置于低溫冰箱中保存（4 ℃）以備用。準(zhǔn)確吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，并將其配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、6.0、18.0、30.0、42.0、54.0 μg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確吸取2.0 mL 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液于比色管中，各加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，充分混勻后置于沸水浴中顯色20 min，之后將其取出，然后置于冷水中冷卻10 min。待冷卻后取出，再靜置10 min。采用紫外分光光度計(jì)在490 nm 處其對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定[17]。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）作為自變量（x），將吸光度A作為因變量（y）進(jìn)行線性回歸分析，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.016 3x+0.017 9，R2=0.998 6。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度處于0～54.0 μg/mL 時(shí)與吸光度存在較強(qiáng)的效應(yīng)關(guān)系。

1.2.4.2 馬齒莧多糖得率

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 份5.000 0 g 馬齒莧粉，按正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝，提取液以6 000 r/min 的速度離心20 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后定容至50 mL。取馬齒莧多糖提取液2 mL，依據(jù)“1.2.4.1”中的相關(guān)操作，測(cè)定其吸光度，馬齒莧多糖得率的計(jì)算公式為：

馬齒莧多糖得率（mg/g）=多糖質(zhì)量（mg）/馬齒莧粉末質(zhì)量（g）

1.2.5 馬齒莧多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

1.2.5.1 DPPH·清除率的測(cè)定

分別取不同濃度馬齒莧多糖提取液及VC 溶液0.2 mL 置于試管中，加入80 mg/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液3.8 mL，搖勻，室溫條件下于黑暗處放置30 min。在波長(zhǎng)517 nm 處分別測(cè)定吸光度Ai，另分別取不同濃度馬齒莧多糖提取液及VC 溶液0.1 mL 置于試管，加入3.9 mL 無(wú)水乙醇，在波長(zhǎng)517 nm 處分別測(cè)定參比吸光度Ab；再取0.1 mL 無(wú)水乙醇，加入80 mg/L 的DPPH·無(wú)水乙醇溶液3.9 mL，在波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定空白吸光度A0[18]。DPPH·清除率計(jì)算公式為：

1.2.5.2 OH·清除率的測(cè)定

分別取不同濃度馬齒莧多糖提取液及VC 溶液2 mL 置于試管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min 后，加入6 mmol/L 水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min。在波長(zhǎng)510 nm 處分別測(cè)定其吸光度Ai；另用蒸餾水代替水楊酸溶液重復(fù)上述試驗(yàn)，測(cè)得參比吸光度Ab；另用蒸餾水代替樣品溶液重復(fù)上述試驗(yàn)，測(cè)得空白吸光度A0[19]。OH·清除率計(jì)算公式為：

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3 次，采用Excel 2016 和Origin 9.0 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對(duì)馬齒莧多糖得率的影響

由圖1 可以看出，纖維素酶添加量0～2.5%時(shí)，馬齒莧多糖得率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。纖維素酶添加量為1.5%時(shí)，多糖得率達(dá)到最高，為18.62 mg/g；纖維素酶添加量增至2.0%時(shí)，馬齒莧多糖得率略有降低，但與添加量1.5%組無(wú)顯著差異；纖維素酶添加量增至2.5%時(shí)，馬齒莧多糖得率繼續(xù)降低。原因可能是纖維素酶濃度達(dá)到一定值后，底物濃度相對(duì)不能飽和，導(dǎo)致酶的作用受阻[20]。同時(shí)，結(jié)果表明雙酶法提取馬齒莧多糖得率顯著高于單一果膠酶提取法（纖維素酶添加量0 時(shí)）得率（P＜0.05）。故選擇纖維素酶添加量1.0%～2.0%用于進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effects of cellulose additions on the yield of polysaccharides

2.2 果膠酶添加量對(duì)馬齒莧多糖得率的影響

由圖2 可知，馬齒莧多糖得率隨著果膠酶添加量的增加呈現(xiàn)出先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)果膠酶添加量為1.6%時(shí)，馬齒莧多糖得率達(dá)到最高，為19.09 mg/g；果膠酶添加量增至2.0%時(shí)，馬齒莧多糖得率略有降低，但與1.6%添加量組無(wú)顯著差異?？赡苁怯捎诠z酶濃度達(dá)到一定值后，底物濃度相對(duì)不能飽和，導(dǎo)致酶作用受阻。同時(shí)，結(jié)果表明雙酶法提取馬齒莧多糖得率顯著高于單一纖維素酶（果膠酶添加量0 時(shí)）提取法得率（P＜0.05）。故選擇果膠酶添加量1.2%～2.0%用于進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 果膠酶添加量對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effects of pectinase additions on the yield of polysaccharides

2.3 酶解時(shí)間對(duì)馬齒莧多糖得率的影響

由圖3 可以看出，提取獲得的馬齒莧多糖得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，到100 min 時(shí)升高到較高水平，為18.85 mg/g；酶解時(shí)間延長(zhǎng)至120 min 時(shí)，馬齒莧多糖得率略有升高，但與100 min 樣品組無(wú)顯著差異。故選擇酶解時(shí)間80～120 min 用于進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

2.4 酶解溫度對(duì)馬齒莧多糖得率的影響

由圖4 可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度范圍內(nèi)，馬齒莧多糖得率先隨著酶解溫度的持續(xù)上升而升高，當(dāng)溫度升至50 ℃時(shí)，馬齒莧多糖得率達(dá)到最大，為19.40 mg/g，而當(dāng)溫度繼續(xù)升高超過(guò)50 ℃，多糖得率反而下降，55 ℃和60 ℃樣品組與50 ℃樣品組相比均存在顯著差異（P＜0.05）?？赡苁怯捎跍囟冗^(guò)高導(dǎo)致酶活性衰減，而使酶解反應(yīng)難以充分進(jìn)行，導(dǎo)致多糖得率下降。故選擇酶解溫度45～55 ℃用于進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)。

2.5 液料比對(duì)馬齒莧多糖得率的影響

由圖5 可以看出，馬齒莧多糖得率隨著液料比的增加而升高，而當(dāng)液料比達(dá)到25∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率最大，為19.24 mg/g。增加提取溶劑添加量可使多糖與溶劑的接觸面增大，從而促使多糖溶出。而液料比25∶1～35∶1（mL/g）時(shí)，多糖得率波動(dòng)幅度相對(duì)不大，與25∶1（mL/g）樣品組無(wú)顯著差異。從經(jīng)濟(jì)性角度考慮，選擇液料比25∶1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 酶解溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis temperatures on the yield of polysaccharides

圖5 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.5 Effects of liquid-solid ratios on the yield of polysaccharides

表2 馬齒莧多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of Portulaca oleracea polysaccharides

2.6 馬齒莧多糖提取的正交試驗(yàn)

由表2 可知，試驗(yàn)中各因素對(duì)馬齒莧多糖得率影響的主次順序?yàn)椋篋＞B＞C＞A，即酶解溫度的影響最大，果膠酶添加量和酶解時(shí)間次之，纖維素酶添加量的影響最小。對(duì)馬齒莧多糖進(jìn)行提取的最優(yōu)組合為：A2B3C2D2，即纖維素酶添加量1.5%，果膠酶添加量2.0%，酶解時(shí)間100 min，酶解溫度50 ℃。為確定最佳提取工藝條件的穩(wěn)定性和可靠性，按照此條件做驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，得到的馬齒莧多糖得率為(19.83±0.41)mg/g，高于正交試驗(yàn)中的所有試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明該工藝條件穩(wěn)定可靠。

2.7 馬齒莧多糖體外抗氧化活性

2.7.1 馬齒莧多糖對(duì)DPPH·的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮族自由基，在無(wú)水乙醇溶液中呈紫色，被還原劑還原后顏色變淡甚至消失，被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化活性[21]。由圖6 可以看出，馬齒莧多糖和VC 對(duì)DPPH·的清除能力與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出較強(qiáng)的依賴(lài)關(guān)系，通過(guò)線性回歸方程計(jì)算得到馬齒莧多糖的半數(shù)清除率IC50為0.182 mg/mL，而VC 的IC50為0.234 mg/mL。說(shuō)明在相同濃度下，馬齒莧多糖對(duì)DPPH·的清除能力強(qiáng)于VC。

圖6 馬齒莧多糖對(duì)DPPH·的清除作用Fig.6 Scavenging effects of Portulaca oleracea polysaccharides on DPPH free radical

2.7.2 馬齒莧多糖對(duì)·OH 的清除作用

·OH 是一種生物體內(nèi)活性最強(qiáng)的氧族自由基，可與水楊酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì)，加入抗氧化劑后，溶液顏色變淺甚至消失[21]。由圖7 可以看出，馬齒莧多糖和VC 對(duì)·OH 的清除能力與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出較強(qiáng)的依賴(lài)關(guān)系，通過(guò)線性回歸方程分析，馬齒莧多糖對(duì)·OH 的IC50為0.305 mg/mL，而VC 對(duì)·OH 的IC50為0.340 mg/mL，說(shuō)明馬齒莧多糖對(duì)·OH 的清除能力強(qiáng)于VC。

圖7 馬齒莧多糖對(duì)OH·的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Portulaca oleracea polysaccharides on OH free radical

3 結(jié)論

我國(guó)每年都會(huì)產(chǎn)生大量馬齒莧野生資源，大多作為飼料供動(dòng)物食用或作為廢棄物被舍棄。研究表明，馬齒莧中含有豐富多糖成分，是一種極具經(jīng)濟(jì)效益的天然多糖來(lái)源。本研究對(duì)馬齒莧多糖纖維素酶和果膠酶雙酶法提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳工藝條件為：纖素酶和果膠酶加入量分別為1.5%和2.0%，酶解時(shí)間100 min，酶解溫度50 ℃，液料比25∶1（mL/g），此提取工藝具有良好的穩(wěn)定性。最佳提取工藝條件下馬齒莧多糖得率為19.83 mg/g，高于單一纖維素酶或果膠酶法提取法得率。體外抗氧化試驗(yàn)表明，馬齒莧多糖具有較好的清除DPPH·和·OH 活性作用。本試驗(yàn)的研究成果為馬齒莧多糖作為保健食品實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論支持，有著良好的發(fā)展前景。