崔曉艷 鐘軻 耿耘 宣寧 孫秀芹 牛旭東 康佳 陳高

摘要：類胡蘿卜素是人體內(nèi)維生素A的主要來源，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌等作用。前期初步推測集胞藻PCC6803中slr0681基因在類胡蘿卜素代謝中有重要作用。本研究利用同源重組方法構(gòu)建了slr0681基因敲除突變株Δslr0681，研究了突變株與野生型在高鹽脅迫條件下葉綠素a和類胡蘿卜素含量變化以及光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，高鹽脅迫下，突變株比野生型更具生命活力;高鹽脅迫下Δslr0681中類胡蘿卜素和葉綠素a含量高于野生型;PSⅠ中psaA、psaB、psaL和PSⅡ中psbB、psbD基因的相對表達(dá)量較野生型分別增加3.4、1.9、1.5倍和2.1、1.6倍。以上結(jié)果表明，slr0681基因?qū)τ诩孱惡}卜素代謝有重要作用，并且在高鹽脅迫條件下影響更為突出。本研究為后續(xù)利用合成生物學(xué)策略提高微藻類胡蘿卜素代謝奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：集胞藻PCC6803;slr0681基因;類胡蘿卜素;高鹽脅迫;光系統(tǒng)

中圖分類號：Q949.22：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2021）12-0001-07

集胞藻PCC6803（以下簡稱集胞藻）是一種單細(xì)胞藍(lán)藻，有天然的外源DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有遺傳背景清晰、表達(dá)外源產(chǎn)物不形成包含體等優(yōu)點(diǎn)[1]，是理想的藍(lán)藻基因工程受體。

類胡蘿卜素在動物和人體中發(fā)揮著重要的作用，如預(yù)防疾病、提高機(jī)體免疫力、維持動物正常生長與繁殖等。類胡蘿卜素是一類脂溶性的類異戊二烯化合物，也是進(jìn)行光合作用、由生物產(chǎn)生的親脂性色素[2]，其可通過猝滅活性氧防止氧化，并且可在光合生物中收集光能[2，3]，在許多生物中起著核心作用。

近年來，類胡蘿卜素在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品以及飼料行業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用[4]。隨著人們健康意識的不斷加強(qiáng)，從天然原料中獲得的類胡蘿卜素受到越來越多消費(fèi)者的歡迎。目前，類胡蘿卜素的生產(chǎn)方式主要有化學(xué)合成、天然提取與生物合成3種。相對于前兩種方式，微生物合成的方式安全、天然，是健康可行的生產(chǎn)類胡蘿卜素方式。

藍(lán)藻中色素的積累受外界環(huán)境的影響，如光照、營養(yǎng)鹽、溫度以及酸度[5-8]等。集胞藻是一種中等耐鹽的淡水藍(lán)細(xì)菌，可在短時間內(nèi)耐受高達(dá)1.2mol/L的氯化鈉。培養(yǎng)基中加入高鹽后可導(dǎo)致集胞藻細(xì)胞內(nèi)自由水減少，且濃度增加的無機(jī)離子對細(xì)胞的新陳代謝產(chǎn)生毒性作用。藍(lán)藻細(xì)胞可使用“鹽外排策略”適應(yīng)高鹽環(huán)境。首先藍(lán)藻細(xì)胞迅速失水和收縮;之后，Na+和Cl-進(jìn)入細(xì)胞降低水勢，水回流到細(xì)胞中;細(xì)胞中高Na+含量會抑制細(xì)胞中的各種生理反應(yīng)，特別是光合作用和翻譯，將有毒的Na+交換為毒性較小的K+可以重新激活光合作用，并開始合成兼容的溶質(zhì);藍(lán)藻的主要相容溶質(zhì)是葡萄糖基甘油，積累葡萄糖基甘油允許多余的離子流出，然后基因表達(dá)再次被激活，最后基因表達(dá)的變化導(dǎo)致完全適應(yīng)高鹽環(huán)境[9]。

地球上淡水資源有限，所以未來生物技術(shù)改造的藍(lán)藻大規(guī)模培養(yǎng)必須依賴海水，因而理想的菌株至少能在海水中生長，且有更高的耐鹽性。集胞藻PCC6803在高鹽條件下有較大比例的轉(zhuǎn)運(yùn)與結(jié)合相關(guān)的基因上調(diào)[10]，slr0681基因編碼鈉鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此研究在高鹽脅迫條件下敲除該基因的突變株Δslr0681的生化指標(biāo)尤為重要。

本試驗(yàn)利用同源重組方法構(gòu)建了slr0681基因敲除突變株Δslr0681，研究了突變株在高鹽脅迫下葉綠素和類胡蘿卜素的變化及光系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)情況，以期為促進(jìn)微藻在生物能源上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 集胞藻PCC6803、質(zhì)粒pBluescriptsk（-）為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自AG公司;限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司;ChamQUniversalSYBRMasterMixes購自Vazyme公司。

1.2 培養(yǎng)條件

集胞藻使用BG-11培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、光照強(qiáng)度40μmol/（m2·s），連續(xù)光照靜置培養(yǎng)[11]，采用SP-723型可見分光光度計(jì)在730nm處測定OD值（OD730），確定細(xì)胞密度。DH5α使用LB培養(yǎng)基于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 Δslr0681突變株的獲得

1.3.1 失活質(zhì)粒構(gòu)建 通過PCR方法用slr0681-1-F（5′GCTTTGCTGGATGTGCCCT3′）/slr0681-1-BamHⅠ-R（5′GGTGGAAAATAGGATCCGTTTGCTCTCAATAAGC3′）、slr0681-2-BamH Ⅰ -F（5′AACGGATCCTATTTTCCACCAAAGCCCATT3′）/slr0681-2-R（5′TTCGGCATGGGCTAACAA3′）引物從集胞藻基因組DNA中分別擴(kuò)增得到slr0681基因的上下游片段。將兩基因片段連接到T3克隆載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并測序，制得slr0681-T3質(zhì)粒。將slr0681-T3質(zhì)粒用BamHⅠ酶切，回收載體片段;用BamHⅠ酶切pBluescriptsk（-）載體，回收卡那霉素抗性片段。用T4連接酶連接載體片段和卡那霉素抗性片段后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。通過篩選陽性克隆，獲得集胞藻slr0681基因敲除載體，命名為pΔslr0681。

1.3.2 集胞藻轉(zhuǎn)化及突變株篩選和鑒定 用質(zhì)粒pΔslr0681轉(zhuǎn)化集胞藻，具體步驟參考Liu等[12]的方法。集胞藻轉(zhuǎn)化子在含有50μg/mL卡那霉素的BG-11固體培養(yǎng)基中長出后，轉(zhuǎn)到含有50μg/mL卡那霉素的液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，并逐步提高卡那霉素濃度至200μg/mL。PCR鑒定卡那霉素抗性基因的插入，直至所有野生型拷貝完全消失，分別以集胞藻和突變株DNA為模板，以slr0681-F（5′ATGATGACTTGGTTGACC3′）和slr0681 -R（5′TTAGATTCCGGTATCGTT3′）為引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測條帶大小，獲得突變株Δslr0681。

1.4 高鹽脅迫處理

將野生型集胞藻（WT）和突變株Δslr0681在含0.51mol/LNaCl（3%，W/V）的BG-11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，OD730值為0.2時，取100mL分裝到250mL三角瓶中。每隔24h觀察不同處理間的表型變化。

1.5 集胞藻生長曲線及葉綠素a和類胡蘿卜素含量測定

將WT和Δslr0681分別接種于正常和高鹽BG-11液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)OD730值至0.2，于30℃、光照強(qiáng)度40μmol（m2·s）條件下培養(yǎng)，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8d取樣，通過每天測定OD730值監(jiān)測其生長情況。

每個樣品另取2mL，于13000r/min離心10min，沉淀用1mLN，N-二甲基甲酰胺溶液重懸，吸打混勻，于13000r/min離心10min，取上清液用分光光度計(jì)分別測定OD461、OD625、OD664值，并根據(jù)公式計(jì)算類胡蘿卜素和葉綠素a含量。

類胡蘿卜素（μg/mL） =（OD461 -0.046×OD664）×4 ;

葉綠素a（μg/mL）=12.1×OD664 -0.17×OD625 。

1.6 類胡蘿卜素的提取及HPLC分析

取各時期WT和Δslr0681樣品各2mL，于13000r/min離心10min，藻沉淀用1mL甲醇溶液懸浮，吸打混勻以萃取細(xì)胞色素，然后13000r/min離心10min，取上清液用高效液相色譜法（HPLC）檢測分析類胡蘿卜素組分。所用色譜柱型號為AcclaimC-18反相柱120A（5μm，4.6mm×250mm），具體步驟參考Liu等[12]的方法。

1.7 qRT-PCR分析

取對數(shù)生長期（OD730值為0.6）集胞藻50mL，7000r/min離心10min，收集沉淀，液氮中研磨，用Trizol法提取RNA[12]。電泳檢測RNA片段完整性，用核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度及純度。用EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA為模板，以集胞藻rnpB為內(nèi)參基因，對光系統(tǒng)PSⅠ中psaA、psaB、psaL基因以及光系統(tǒng)PSⅡ 中psbA2、psbD、psbB基因進(jìn)行表達(dá)量分析[13]。所用熒光染料為ChamQUniversalSYBRMasterMixes，系統(tǒng)為ABI7500實(shí)時PCR，使用2-△△Ct方法分析實(shí)時定量PCR數(shù)據(jù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftExcel2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，所有數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)平均值，使用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 slr0681基因的敲除

在slr0681基因中加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，與卡那霉素抗性片段連接，構(gòu)建slr0681基因定向敲除載體（圖1A）。

以集胞藻為模板，以slr0681-F和slr0681-R為引物擴(kuò)增得到slr0681基因片段（1.2kb）。以Δslr0681DNA為模板，以相同引物對擴(kuò)增，得到約1.4kb左右的片段，并且在1.2kb處沒有片段（圖1B）。表明卡納霉素抗性片段已經(jīng)以雙交換方式整合到集胞藻染色體上，突變株Δslr0681構(gòu)建成功。

2.2 WT和Δslr0681在高鹽脅迫條件下的生長情況

正常培養(yǎng)條件下，Δslr0681生長速率均低于WT，在第5d二者濃度差達(dá)到最大，但第6d后兩者濃度差逐漸變小（圖2A）。高鹽脅迫條件下，從第5d開始突變株的濃度均高于WT（圖2B），說明敲除slr0681基因在一定程度上影響了藻株的生長。WT在高鹽脅迫初期適應(yīng)能力更強(qiáng)，Δslr0681生長有較長的遲緩期，但5d后生命活力高于WT，這可能是由于slr0681基因的缺失導(dǎo)致更多的有毒Na+排出，增強(qiáng)了集胞藻的耐鹽性，從而促進(jìn)了高鹽脅迫下Δslr0681的生長。

2.3 WT和Δslr0681在高鹽脅迫條件下的表型變化

高鹽脅迫下WT和Δslr0681相較于正常培養(yǎng)條件下的生長處于弱勢狀態(tài)。正常條件下培養(yǎng)的WT和Δslr0681顏色無明顯差異，而在高鹽脅迫下培養(yǎng)到第6d時，WT和Δslr0681顏色差異最為明顯，Δslr0681比WT更具生命活力（圖3）。表明slr0681基因敲除對于藻株的生長產(chǎn)生了影響。

2.4 WT和Δslr0681在高鹽脅迫條件下的類胡蘿卜素和葉綠素a含量變化

由圖4可知，在正常培養(yǎng)和高鹽脅迫培養(yǎng)的前7d，WT和Δslr0681中類胡蘿卜素含量隨著藻株的生長不斷增加，第8d則降低。正常培養(yǎng)條件下，WT的類胡蘿卜素含量均高于Δslr0681，第5d時差異明顯，差值達(dá)1.23μg/mL;第6～8d差異逐漸減?。▓D4A）。高鹽脅迫條件下，Δslr0681從第5d開始類胡蘿卜素含量明顯高于WT，第7d差值最大，為0.356μg/mL（圖4B）。

正常培養(yǎng)條件下，WT和Δslr0681的葉綠素a含量隨培養(yǎng)時間延長逐漸增加，且二者差異不明顯（圖5A）。高鹽脅迫條件下，WT和Δslr0681的葉綠素a含量呈先升高后降低趨勢，在第4d差值最大，為1.40μg/mL（圖5B）。

利用HPLC法檢測WT和Δslr0681中類胡蘿卜素各組分相對含量，發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫條件下，與WT相比，Δslr0681中海膽酮含量積累最為突出。這可能是因?yàn)閟lr0681基因的敲除增強(qiáng)了藻株的耐鹽性，促進(jìn)了高鹽脅迫下Δslr0681的生長，從而增加了類胡蘿卜素和葉綠素a的含量;slr0681基因的敲除可能會間接影響類胡蘿卜素代謝途徑中某些基因的表達(dá)，促進(jìn)海膽酮積累。

2.5 WT和Δslr0681光系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量

類胡蘿卜素中β-胡蘿卜素是光系統(tǒng)組分的核心，本試驗(yàn)對光系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件下，Δslr0681PSⅠ中psaA、psaB、psaL基因表達(dá)量比WT低，PSⅡ中psbA2、psbD、psbB基因表達(dá)量與WT差異不大（圖6A）。高鹽脅迫條件下，Δslr0681中psaA、psaB、psaL、psbB、psbD基因的表達(dá)量分別是WT的3.4、1.9、1.5、2.1、1.6倍（圖6B）。這可能是因?yàn)閟lr0681基因影響藻株中某個或某些基因的表達(dá)，使PSⅠ和PSⅡ中相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化。

3 討論與結(jié)論

藍(lán)藻是藻類中最早能穩(wěn)定表達(dá)外源基因的種類[14，15]。集胞藻是研究代謝調(diào)控的模式生物，也是用合成生物學(xué)改造構(gòu)建細(xì)胞工廠的優(yōu)良底盤[16，17]。Koch等[18]對集胞藻Slr0058蛋白的研究結(jié)果表明，Slr0058是一種參與PHB（聚-β-羥丁酸）形成的新型調(diào)節(jié)蛋白，在氮脅迫下Slr0058在PHB形成中起促進(jìn)作用，該研究有助于更好地了解集胞藻的PHB代謝以及PHB的可持續(xù)工業(yè)生產(chǎn);Mohamed等[19]研究了集胞藻中Sll0254編碼產(chǎn)藍(lán)藻葉黃素的雙功能番茄紅素環(huán)化酶/雙加氧酶，結(jié)果表明Sll0254基因不僅影響藻株生長，還具有番茄紅素環(huán)化酶和雙加氧酶活性，為微藻類胡蘿卜素代謝研究提供了理論基礎(chǔ)。本研究前期初步推測集胞藻中slr0681基因在類胡蘿卜素代謝中有重要作用。本試驗(yàn)利用同源重組方法構(gòu)建了slr0681基因敲除突變株Δslr0681，結(jié)果表明slr0681基因的敲除影響了藻株的生長、類胡蘿卜素的合成以及光系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)。由于藻類生長和類胡蘿卜素代謝基因調(diào)控的錯綜復(fù)雜性，本研究還無法判斷slr0681基因的具體作用位置。

集胞藻中色素的積累受光照、氮濃度以及鹽濃度等外界環(huán)境的影響[1，20，21]。Li等[22]研究了一種鎂轉(zhuǎn)運(yùn)體slr1216參與集胞藻的鈉耐受性，表明轉(zhuǎn)運(yùn)體slr1216可能通過影響細(xì)胞內(nèi)糖基甘油的表達(dá)參與耐鹽調(diào)節(jié)，這為集胞藻在高鹽脅迫條件下生長提供了理論指導(dǎo)。利用藍(lán)藻抗鹽機(jī)制可構(gòu)建對鹽耐受能力更高的菌株從而進(jìn)行生物燃料的大規(guī)模生產(chǎn)。然而，目前的研究結(jié)果并不能全面闡述藍(lán)藻對鹽脅迫的反應(yīng)機(jī)理，因此要想最大限度提高藍(lán)藻對鹽的耐受性，從而實(shí)現(xiàn)高濃度鹽下的大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)，還需要進(jìn)行深入的研究[22]。

slr0681是一種鈉鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但作用位置尚不清楚。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了slr0681基因敲除突變藻株，得出slr0681基因?yàn)榭果}調(diào)節(jié)因子，與類胡蘿卜素代謝相關(guān)，能夠影響光系統(tǒng)中相關(guān)基因的表達(dá)，為我們進(jìn)一步研究該基因的具體性質(zhì)和逆境條件下的具體功能奠定了基礎(chǔ)。