余甜甜，張麗杰，馬爭發(fā)，張 湄，譚維群，吳前林

（重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 404100）

隨著工業(yè)發(fā)展以及人類活動的進(jìn)行，重金屬逐漸在人類生活的周邊環(huán)境中積累，其具有毒性大、隱蔽性強(qiáng)、易積累、難降解的特點(diǎn)，并參與食物鏈循環(huán)，最終在生物體內(nèi)積累，對生態(tài)環(huán)境和人體健康的危害極大［1－2］。

微生物法是處理重金屬污染的重要手段之一，微生物篩選及其吸附重金屬的機(jī)理研究已有大量報(bào)道，但是重金屬鎘的毒性大，對微生物的生長及群落多樣性的抑制作用較大［3－5］，因此高耐受重金屬鎘的微生物的篩選及其吸附效果的研究較少。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，有些微生物經(jīng)過馴化可具有重金屬高耐受性，高耐鎘細(xì)菌貪銅菌屬細(xì)菌的最大耐受濃度達(dá)到2 248．2 mg／L，高耐鎘芽孢桿菌最大耐受濃度達(dá)到3 900 mg／L，真菌相對于細(xì)菌及放線菌具有較高的重金屬耐受性，高耐鎘真菌－淡紫擬青霉菌的最大耐受濃度達(dá)到80 mmol／L，在Cd2＋濃度為100 mg／L時(shí)，吸附率為68．8%［6－7］。本實(shí)驗(yàn)從富集了大量重金屬的化工廠旁土壤中篩選出一株絲狀真菌——球孢白僵菌。球孢白僵菌是國內(nèi)應(yīng)用最廣泛的一種昆蟲病原真菌［8］，球孢白僵菌的重金屬吸附能力已有相關(guān)報(bào)道，在此次研究中，球孢白僵菌經(jīng)過梯度馴化后，展現(xiàn)出對鎘具有高耐受能力和高吸附能力，真菌通過生物吸附或生物積累等生物代謝活動有效地去除重金屬，真菌中的曲霉、根霉、木霉和青霉的金屬耐受性與其去除金屬的能力之間具有相關(guān)性［9－12］，因此馴化后菌株的吸附效果研究是必要的。本文對篩選出的球孢白僵菌在平板上進(jìn)行耐受性研究，探究了該菌株對低濃度以及高濃度鎘的吸附效果，以期為重金屬污染環(huán)境的修復(fù)提供參考。

1 材料和方法

1．1 主要材料與試劑

1．1．1 土壤來源

采集自重慶市民豐化工廠周邊土壤，使用土壤采集器取樣距離地表5～20 cm的土壤。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)試劑

酵母膏提取物，分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；蛋白胨，分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，分析純，成都市科龍化學(xué)試劑廠；瓊脂粉，分析純，重慶市北碚化學(xué)試劑廠；氯化鎘，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；硝酸，分析純，上海恒信化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，浙江省溫州市東開化工試劑廠。

1．1．3 實(shí)驗(yàn)儀器

電熱恒溫水浴鍋，HHS，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；電子天平，BSM220．4，上海卓精電子科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，SIGMA 3 18ks，成貫儀器上海有限公司；冷凍離心機(jī)，TGL 16M，湖南湘儀離心機(jī)有限公司；紫外分光光度計(jì)，721，重慶川儀分析儀器有限公司；高壓滅菌鍋，GI54DWS，致微儀器有限公司；超凈工作臺，IS09001，上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱，SPX 80B，天津宏諾儀器有限公司；pH酸度計(jì)，PHSJ 4F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；凝膠電泳儀，DYY 8C，北京六一生物科技有限公司；原子吸收光譜儀，AA800，鉑金埃爾默儀器上海有限公司。

1．1．4 培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基：酵母粉（5 g／L）；蛋白胨（10 g／L）；氯化鈉（5 g／L）。

固體培養(yǎng)基：酵母粉（5 g／L）；蛋白胨（10 g／L）；氯化鈉（5 g／L）；瓊脂粉（18 g／L）。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 耐鎘菌株的土樣采集

實(shí)驗(yàn)選取民豐化工廠旁土壤作為取樣區(qū)。在去掉土壤表層雜物和浮土后，使用土壤采集器取樣距離地表5～20 cm的土壤，以梅花五點(diǎn)法進(jìn)行打孔采樣，將五點(diǎn)樣品混合均勻后用聚乙烯采樣袋收集并封口，最后保存在3～8℃的冰箱中，備用。

1．2．2 耐受鎘離子球孢白僵菌的篩選

稱10 g采集的土壤，與無菌水充分混合，靜置30 min。取1 mL上清液加入到培養(yǎng)基中，30℃，170 r／min搖床中培養(yǎng)2 d，待培養(yǎng)基變得渾濁，取1mL的菌懸液加入到含鎘濃度400 mg／L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～5 d后取200μL菌懸液涂布到鎘濃度在400 mg／L的LB固體平板上培養(yǎng)，將生長狀況良好的單菌落逐步轉(zhuǎn)接到更高濃度的平板上，進(jìn)行馴化，最后將得到的單菌落在平板上劃線轉(zhuǎn)接3次以上進(jìn)行菌種純化。

1．2．3 菌屬鑒定

真菌物種鑒定是使用ITS rDNA作為Marker片段，根據(jù)真菌rDNA的ITS區(qū)設(shè)計(jì)出特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出基因中ITS序列，隨后進(jìn)行電泳檢測。利用DNA凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增出來的ITS序列，并由上海美吉公司使用3730XL測序儀進(jìn)行一代雙末端測序，獲得abi測序峰圖文件，通過軟件組裝后，與NT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得相似序列的物種信息，借助同源比對的方法輔助判斷物種信息。

1．2．4 掃描電鏡觀察

用含鎘2 000 mg／L的液體培養(yǎng)基與不含鎘的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，待培養(yǎng)基中菌體充分生長后，分別取樣1 mL，4 000 r／min離心8 min，去上清，用2．5%的戊二醛溶液固定菌體3 h，隨后使用磷酸緩沖液沖洗3次，乙醇梯度脫水30%、50%、70%、85%、95%各1次，100%乙醇2次，15～20 min／次，最后進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥，使用掃描電鏡觀察菌體表面形貌的變化。

1．2．5 梯度馴化以及耐受性測定

將分離的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：30℃，170 r／min，培養(yǎng)24 h。將活化后的菌液取1μL點(diǎn)樣到含鎘分別為50、500、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 mg／L的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行梯度培養(yǎng)，并配制對照平板（不含金屬鹽）。所有平板都是在（25±2）℃下培養(yǎng)14 d，以觀察真菌生長情況。真菌通過在高金屬濃度下的大量生長來表達(dá)對金屬的耐受性。可以通過耐受指數(shù)（TI）對耐受程度進(jìn)行量化，在整個(gè)培養(yǎng)期間的隔日對平板拍照，測量菌落的半徑并計(jì)算耐受性系數(shù)（TI）［15－16］：

1．2．6 重金屬離子吸附效果優(yōu)化

1）最適溫度的優(yōu)化

將菌株培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種以2．5%的接種率接種到LB液體培養(yǎng)基中，總體積為40 mL，鎘濃度為100 mg／L，將三角瓶置于不同溫度下（10、15、20、25、30、35、40℃），170 r／min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至3 d后取菌液，8 000 r／min離心5 min。使用原子吸收光譜儀測量上清液中的鎘離子含量，上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2）最適pH值的優(yōu)化

按照1）的操作，將菌液接種到pH值分別為4 0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0、10．0的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)結(jié)束后測量鎘離子含量。

3）最適接種量的優(yōu)化

按照1）的操作，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液分別以接種量2．5%、5%、7．5%、10%接入裝有LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)結(jié)束后，測量鎘離子含量。

4）重金屬濃度對菌株吸附率的影響

將馴化后的菌株培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種以7 5%的接種率接種到LB液體培養(yǎng)基，總體積為40 mL，液體培養(yǎng)基中鎘濃度分別為20、40、60、80、100、200、400、600、800、1 000 mg／L，置于25℃下170 r／min振蕩培養(yǎng)。隔天取樣，取樣時(shí)長為7 d，8 000 r／min離心5 min。使用原子吸收光譜儀測量上清液中的重金屬含量，上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．7 液體培養(yǎng)基中真菌對重金屬的吸附效果

測量之前配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)儀器的使用范圍配制濃度梯度標(biāo)液，使用配標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)1．2．5的實(shí)驗(yàn)方法，將菌液培養(yǎng)3 d后，將樣品離心（8 000 r／min，5min）以獲得無細(xì)胞上清液，使用原子吸收光譜（AAS）用于金屬定量檢測。去除的金屬百分比（Y，%）為

式中：C0為初始金屬濃度（mg／L）；C1為最終金屬濃度（mg／L）。

2 結(jié)果與分析

2．1 菌株的形態(tài)特性

菌落在LB固體平板上生長狀況如圖1（a）所示，菌落呈發(fā)散狀，白色，中間褶皺、菌落薄，質(zhì)地呈現(xiàn)毛絨狀，菌落底部無色或淡黃色，如圖1（b）。在10×100倍顯微鏡下，分生孢子透明、壁薄呈球形或橢圓形，初步判斷該菌株為絲狀真菌。

圖1 菌株Z1在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征

2．2 菌株Z1的分子生物學(xué)鑒定

瓊脂凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，DL2000條帶分布：2 000、1 000、750、500、250、100 bp，可知真菌的ITS序列在500 bp左右，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST比對該菌的真菌rDNA的ITS區(qū)，并構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖3，根據(jù)BLAST結(jié)果顯示與Beauveria bassiana B1和eauveria bassiana strain ARP14同源性為99%，與Beggiatoa leptomitoformis strain D 402和Beggiatoa alba同種，菌株Z1為白僵菌。ITS序列測序峰圖見圖4。

圖2 電泳結(jié)果

圖3 菌株Z1的基于ITSrRNA序列的 系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖

圖4 ITS序列測序峰圖

2．3 掃描電鏡觀察真菌表面形態(tài)變化

如圖5（a）所示，掃描電鏡觀察下可以看到旺盛生長的菌絲，菌絲光滑，但在菌絲或分生孢子梗上未觀察到孢子，可能是由于取樣時(shí)間的選擇不恰當(dāng)。在含鎘的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體的掃描電鏡圖如圖5（b）所示，菌體并無明顯變形，仍呈現(xiàn)光滑細(xì)長狀，但其表面有微小物質(zhì)附著，此次電鏡觀察到Cd2＋與菌絲發(fā)生復(fù)雜的相互作用后沉積在菌絲表面的現(xiàn)象。

圖5 菌株Z1分別在不含鎘與含鎘液體培養(yǎng)基中的 掃描電鏡圖

2．4 菌株Z1對重金屬鎘的耐受性

真菌在高金屬濃度下的生長情況可表示其對金屬的耐受性，可以通過耐受指數(shù)（TI）對耐受程度進(jìn)行量化：TI值為0，表示對重金屬完全沒有耐受性；TI＜1，表明相對于對照，重金屬脅迫下真菌生長受到抑制；TI值為1，表示相對于對照組，重金屬脅迫下真菌的生長相似；TI＞1，表明重金屬脅迫下真菌的生長超過對照，因此，高TI表明菌株良好的金屬耐受性。將TI值（14 d）作圖6，真菌在金屬脅迫的情況下可存在5個(gè)生長階段：（a）生長滯后；（b）快速生長，但絕對生長受到抑制，即TI＜1；（c）生長率下降；（d）類似生長，TI值在1附近；（e）增強(qiáng)生長，即TI＞1，有些菌株應(yīng)對重金屬脅迫時(shí)沒有增強(qiáng)生長階段［14］。白僵菌Z1在重金屬濃度為50～3 000 mg／L時(shí)無滯后生長，耐受性系數(shù)TI（0．48～0．88），表現(xiàn)出高耐受性［14］；在重金屬濃度為3 500～9 000 mg／L時(shí)存在滯后生長，滯后時(shí)間為1 d，耐受性系數(shù)TI（0 14～0．50）；在重金屬濃度為50～9 000 mg／L時(shí)，白僵菌Z1均未表現(xiàn)出增強(qiáng)生長階段，該菌株在b階段TI值的增長速率較高，在c階段TI值的降幅度較小，表現(xiàn)出較強(qiáng)的重金屬耐受性［14］。

2．5 重金屬吸附優(yōu)化

2．5．1 溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

白僵菌Z1的最適溫度如圖7所示，在實(shí)驗(yàn)的溫度范圍內(nèi)，Z1對重金屬的鎘的吸附率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，25℃達(dá)到最大吸附率60 1%。白僵菌Z1對鎘的吸附率變化與溫度變化相關(guān)，溫度在20～30℃對重金屬鎘的吸附效果較好，溫度過高、過低均對重金屬鎘的吸附產(chǎn)生不利影響。

圖6 白僵菌Z1對重金屬鎘的耐受性結(jié)果

圖7 溫度對菌株Z1吸附Cd2＋的影響

2．5．2 pH優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

白僵菌Z1的最適pH值如圖8所示，在實(shí)驗(yàn)的pH值范圍內(nèi)，Z1對重金屬的鎘的吸附率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在pH值為6時(shí)，達(dá)到最大吸附56．17%。pH值降低或升高均對菌株Z1吸附鎘產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖8 pH對菌株Z1吸附Cd2＋的影響

2．5．3 最適接種量的優(yōu)化

白僵菌Z1的最適接種量如圖9所示，白僵菌Z1對重金屬鎘的吸附率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，隨著接種量的增加，白僵菌Z1的吸附率也隨之增加，在接種量為7．5%時(shí)，達(dá)到最大吸附率76．2%。

圖9 接種量對菌株Z1吸附Cd2＋的影響

圖10 菌株在不同鎘濃度下的最大生長量直方圖

2．5．4 重金屬濃度－時(shí)間對菌株吸附率的影響

在不同的Cd2＋濃度下，菌株Z1的生長情況均良好（見圖10）；連續(xù)測定菌株Z1對Cd2＋的吸附率，結(jié)果如圖11所示，由圖11可知：菌株Z1對Cd2＋的吸附存在累積的過程，隨著時(shí)間的增加，菌株Z1對Cd2＋的吸附率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)（20～1 000 mg／L），隨著Cd2＋濃度的不斷增加，菌體最大吸附率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在鎘離子濃度為40 mg／L時(shí)，吸附率可達(dá)97．4%。在20～40 mg／L，隨著濃度的增加，鎘的吸附率逐漸增加；40～100 mg／L，隨著濃度的增加，菌體對Cd2＋的吸附率逐漸下降。在較高的重金屬濃度范圍內(nèi)（200～1 000 mg／L），菌株Z1的吸附率呈現(xiàn)升高的趨勢，在重金屬高達(dá)1 000 mg／L時(shí)，菌體對Cd2＋的吸附率可達(dá)到92．1%（見圖12）；菌株Z1對Cd2＋的單位吸附率在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)先升高后降低，在1 000 mg／L時(shí)達(dá)到最大，單位吸附率達(dá)到101．26 mg／g（見圖13）。

圖11 菌株Z1對Cd2＋的吸附效果

圖12 菌株Z1對不同濃度Cd2＋的最大吸附率

圖13 菌株Z1對不同濃度鎘的單位吸附量直方圖

3 討論

微生物處理重金屬污染具有高效、成本低、無二次污染的優(yōu)點(diǎn)，其中利用真菌的吸附作用是治理重金屬污染的重要手段之一。本次研究通過在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行耐鎘梯度馴化后得到高耐鎘且具有高吸附率的球孢白僵菌Z1，對該菌株的鎘耐受程度、吸附效果及影響因素進(jìn)行了深入的探討，研究表明球孢白僵菌Z1在固體培養(yǎng)基中能耐受Cd2＋的濃度高達(dá)9 000 mg／L，與已篩選出的耐鎘真菌綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、青霉（Penicillium sp．）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）相比具有高耐受性［15－18］，同時(shí)與高耐鎘菌株相比具有高吸附率。Gola等［19］對球孢白僵菌對多種重金屬的吸附效果進(jìn)行研究，其中球孢白僵菌對鎘的最大耐受濃度為200 mg／L，對初始濃度為30 mg／L的Cd2＋的吸附率為63．4%，本文中經(jīng)過梯度馴化后得到的球孢白僵菌Z1對鎘Cd2＋的濃度高達(dá)9 00 mg／L，且其對Cd2＋的吸附效果也大為提高，對初始濃度為20 mg／L的Cd2＋的吸附率為96．4%，對初始濃度為40 mg／L的Cd2＋的吸附率為98．0%。

研究表明：溫度是影響重金屬吸附效果的重要因素，溫度對該菌株吸附Cd2＋能力影響的敏感程度要遠(yuǎn)大于pH的影響，在20～30℃時(shí)，球孢白僵菌Z1對Cd2＋的吸附效果要明顯優(yōu)于其他溫度，可能是在這個(gè)溫度范圍內(nèi)，菌株在應(yīng)對鎘脅迫時(shí)能更好地分泌抗氧化脅迫的酶類物質(zhì)，過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化脅迫的酶類物質(zhì)能減輕重金屬引起的生理毒害［20］，在實(shí)驗(yàn)的pH值范圍內(nèi)，pH值呈現(xiàn)中性時(shí)具有較好的吸附效果；實(shí)驗(yàn)表明菌液接種量為7．5%吸附效果最好，菌株對Cd2＋效果并未隨著接種量的增加而增強(qiáng)，這是因?yàn)檎婢?xì)胞細(xì)胞壁上含有弱酸性羧基基團(tuán)，帶正電荷，在重金屬溶液中，細(xì)胞表面活性基團(tuán)中的質(zhì)子與重金屬離子發(fā)生離子交換，將重金屬離子吸附在細(xì)胞表面，而當(dāng)溶液中菌株的接種量過多，真菌細(xì)胞間因?yàn)榫鶐д姾纱嬖谙嗷ヅ懦庾饔煤臀轿稽c(diǎn)相互競爭作用進(jìn)而影響其對帶正電荷的重金屬離子的吸附效率［1］。

在菌株Z1吸附Cd2＋的研究中發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間的延長，球孢白僵菌Z1對Cd2＋的吸附能力逐步升高，在第4～5 d達(dá)到最大吸附率，隨后吸附率下降，可能是因?yàn)榫w死亡后積累在菌體內(nèi)部的鎘釋放到培養(yǎng)液中，Cd2＋的濃度也影響吸附重金屬Cd2＋的效果，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)（20～1 000 mg／L），隨著Cd2＋濃度的不斷增加，菌體對它們的吸附率的總體趨勢是先下降后升高，在重金屬濃度（20～100 mg／L）時(shí)對Cd2＋的吸附效果較好，吸附率可達(dá)到76．7%以上，在重金屬濃度為200 mg／L時(shí)吸附率最低為62．5%，而在較高的重金屬濃度范圍內(nèi)（200～1 000 mg／L），球孢白僵菌Z1對Cd2＋的吸附率呈現(xiàn)升高的趨勢，在重金屬高達(dá)1 000 mg／L時(shí)，菌體對Cd2＋的吸附率可達(dá)到92．1%。在低濃度Cd2＋環(huán)境下菌體的細(xì)胞壁表面能夠提供大量的吸附活性位點(diǎn)，所以菌體對金屬離子的吸附率較高，隨著Cd2＋濃度的不斷增大，細(xì)胞壁表面的吸附位點(diǎn)達(dá)到飽和，降低了Cd2＋的吸附率；在Cd2＋濃度較高的培養(yǎng)基中，菌株吸附率卻逐漸上升可能是真菌應(yīng)對較高濃度重金屬脅迫時(shí)，對重金屬不單單依靠細(xì)胞壁表面基團(tuán)的吸附，還有胞內(nèi)沉淀等生物功能活動進(jìn)行，生物吸附與生物積累等機(jī)制同時(shí)進(jìn)行以抵御鎘對菌體的脅迫［21－23］。本次實(shí)驗(yàn)篩選出的對鎘具有高耐受性且高吸附率的球孢白僵菌Z1可為微生物處理重金屬廢水和土壤提供新的高效且廉價(jià)的選擇，下一步可從基因?qū)用鎸︽k的高耐受性進(jìn)行深入分析，為構(gòu)建高效率的基因工程菌提供理論基礎(chǔ)。