紀(jì)紅燕，吳佳妮，吳欣圓，吳秀麗，何 娜，劉 成*(.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，銀川 750004；.寧夏醫(yī)科大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究中心，銀川 750004；.銀川知微生物科技有限公司，銀川 750004)

桑黃(Phellinusigniarius)為多年生藥用真菌，《神農(nóng)本草經(jīng)》中稱其為桑耳，是國(guó)際公認(rèn)的抗癌效果較好的大型藥用真菌[1-2]。前期在其子實(shí)體中發(fā)現(xiàn)具有抗氧化、抗腫瘤等作用的生物活性物質(zhì)hispidin衍生物[3-6]。由于野生桑黃資源有限，為了尋找替代資源，前期對(duì)桑黃的基原菌種火木層孔菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了深入研究[7]，但并未分離得到hispidin衍生物等成分。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)菌株發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行適當(dāng)?shù)卣T導(dǎo)調(diào)控，有利于提高活性成分的含量[8-10]。而內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生一類可誘導(dǎo)藥用植物細(xì)胞生物合成次生代謝產(chǎn)物的物質(zhì)，稱為內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子，屬于外源性誘導(dǎo)子[11-12]。因此，本研究利用野生桑黃子實(shí)體中的內(nèi)生真菌對(duì)火木層孔菌菌株的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行誘導(dǎo)調(diào)控，以hispidin衍生物等成分作為對(duì)照，初步考察內(nèi)生真菌誘變對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，為藥用真菌桑黃的有效開(kāi)發(fā)和野生資源替代提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Thermo Forma 311型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermal公司)；SPX-250-GB型智能光照培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)；HYG-A型全溫?fù)u瓶柜(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司)；高倍倒置光學(xué)顯微鏡-連接照相裝置(CCD)(日本Olympus公司)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；YM75A型高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；Hitachi S-3400N型掃描電鏡(美國(guó)EMS公司)。

1.2試藥 液體發(fā)酵培養(yǎng)基(商用馬丁培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)。

1.3菌種 火木層孔菌(Phellinusigniarius)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生物合成室戴均貴研究室提供；菌源購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC 5.95)。

2 方法

2.1內(nèi)生真菌的分離與純化 取表面徹底清潔后的野生桑黃子實(shí)體在超凈工作臺(tái)中切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊，子實(shí)體小塊的表面先用10 mL·L-1次氯酸鈉消毒，再用無(wú)菌水沖洗以去除子實(shí)體表面的次氯酸鈉殘留物，反復(fù)3次，繼而采用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇消毒，并用無(wú)菌水沖洗，各3次。用滅菌后的刀片將經(jīng)徹底消毒的組織切成直徑約為0.5 cm的薄片放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar medium with antibiotics，PDA)培養(yǎng)基中(馬鈴薯200 g·L-1，葡萄糖的質(zhì)量濃度為20 g·L-1，瓊脂的質(zhì)量濃度為20 g·L-1，青霉素的質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1，蒸餾水1 L)。置于28 ℃避光培養(yǎng)3～7 d，待內(nèi)生真菌的菌絲長(zhǎng)出后，采用反復(fù)劃線法進(jìn)行純化并命名保存，待用。

2.2內(nèi)生真菌的掃描電鏡顯微觀察 將真菌菌株接種于改良馬丁固體培養(yǎng)基，將經(jīng)滅菌處理的蓋玻片以45°夾角插入菌落生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d后，將蓋玻片輕輕拔出，用0.1 mol·L-1的二甲砷酸鈉緩沖液快速?zèng)_洗2次，放入2.0 mL·L-1戊二醛溶液中固定2 h(有菌絲的一面朝上)。固定后，用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液沖洗3次(間隔2 h更換緩沖液1次)，最后用0.1 mol·L-1二甲砷酸鈉緩沖液于4 ℃條件下固定12 h以上，依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%的乙醇及乙醇脫水，每次脫水時(shí)間為10～15 min。用體積分?jǐn)?shù)為95%的叔丁醇溶液置換2次，每次15 min，再用100%的叔丁醇溶液置換15 min，置換完畢后將樣品放置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷20 min。經(jīng)冷凍干燥處理，離子濺射儀噴鍍后，將制做好的樣品，放置于掃描電鏡下，在10 kV下觀察菌株的形態(tài)。

2.3生物誘導(dǎo)子對(duì)火木層孔菌的誘導(dǎo)過(guò)程

2.3.1火木層孔菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將活化好的火木層孔菌接種于真菌培養(yǎng)基中，于28 ℃以180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，隔天取樣，培養(yǎng)至第20天。減壓抽濾真菌培養(yǎng)液，得到菌絲體，于60 ℃烘干后稱質(zhì)量。以培養(yǎng)時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)、菌絲體干質(zhì)量(g)為縱坐標(biāo)，繪制火木層孔菌的生長(zhǎng)曲線。

2.3.2生物誘導(dǎo)子的制備及誘導(dǎo)過(guò)程 挑取經(jīng)純化的桑黃內(nèi)生真菌菌絲體放入PDA液體培養(yǎng)基(去除瓊脂)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，于28 ℃以180 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)完成后分別將菌絲體與菌液分離(減壓抽濾)，反復(fù)用蒸餾水洗滌菌絲體3次，除去水分后轉(zhuǎn)移菌絲體至組織勻漿機(jī)中，制備菌絲體勻漿。取制備好的菌絲體勻漿5 mL放入15 mL離心管中，并添加蒸餾水至15 mL，以4 600 r·min-1離心20 min，上清液即為內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子，于121 ℃滅菌20 min后添加至已處于生長(zhǎng)旺盛期的火木層孔菌液體培養(yǎng)液中，以相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)1周。

2.4高效液相色譜分析

2.4.1樣品處理 將上述添加了真菌誘導(dǎo)子共培養(yǎng)的火木層孔菌培養(yǎng)液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并后濃縮。取10 mg樣品溶解于1 mL甲醇，過(guò)濾后備用。

2.4.2色譜條件 色譜柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(見(jiàn)表1)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：380 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定

2.5.1液質(zhì)聯(lián)用高效液相條件 流動(dòng)相為甲醇(A)-2 mL·L-1甲酸水溶液(B)；流速：0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：380 nm。高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 乙酸乙酯層提取物流動(dòng)相洗脫梯度Tab.1 Liquid phase elution gradient of ethyl acetate layer extract

2.5.2質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧雙噴離子源(dual AJS ESI)正、負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：3 500 V；干燥氣溫度：350 ℃；流速：12 L·min-1；霧化氣電壓：40 Psi；掃描范圍m/z(100～1 000)。

3 結(jié)果

3.1桑黃中內(nèi)生真菌的分離結(jié)果 應(yīng)用反復(fù)劃線法，共分離得到12株內(nèi)生真菌，菌落照片見(jiàn)圖1。在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d后，于掃描電鏡低倍鏡(× 1 500)下觀察內(nèi)生真菌菌絲體的細(xì)節(jié)，見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，除SHM-1、SHTD-2和HHTD-3的菌絲體較為發(fā)達(dá)外，其余真菌產(chǎn)孢子量非常豐富，孢子大部分為球形，也有梭形和桿形。

圖1 野生桑黃子實(shí)體中內(nèi)生真菌菌落的照片F(xiàn)ig.1 Photographs of endophytic fungi colonies in wild body of P.igniarius

圖2 內(nèi)生真菌在掃描電鏡下的照片 (×1 500)Fig.2 Image of endophytic fungi under scanning electron microscope (×1 500)

3.2火木層孔菌的生長(zhǎng)曲線 見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，在培養(yǎng)火木層孔菌14～16 d時(shí)，其進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期，菌絲體干質(zhì)量的最大值約為0.5 g，因此選擇該培養(yǎng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(15 d)加入生物誘導(dǎo)子，考察生物誘導(dǎo)子對(duì)火木層孔菌次生代謝的影響。

圖3 火木層孔菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of P.igniarius

3.3生物誘導(dǎo)子對(duì)火木層孔菌次生代謝的影響 通過(guò)HPLC-二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector，DAD)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在380 nm(桑黃素類成分的最大吸收波長(zhǎng))處，火木層孔菌的次級(jí)代謝有3個(gè)主峰(見(jiàn)圖4)。經(jīng)誘導(dǎo)子SHTD-4、HHTD-3、HHTD-2和SHM-2調(diào)控后的火木層孔菌的次級(jí)代謝變化較大(見(jiàn)圖5)，其中SHTD-4、HHTD-2和HHTD-3都使火木層孔菌次級(jí)代謝峰1的量增加而峰2和峰3的量有所下降，而用SHM-2誘導(dǎo)后，原峰1～3的含量均下降，在12 min之后出現(xiàn)一個(gè)新峰，通過(guò)與對(duì)照品做對(duì)照(見(jiàn)圖6)和應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)負(fù)離子模式進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)分析(見(jiàn)圖7)，確定該峰為phelligridin G([M-H]-593.1779，分子式為C32H20O12，相對(duì)分子質(zhì)量為594.474 3。

圖4 火木層孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的HPLC圖注：1、2、3峰為火木層孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。Fig.4 HPLC chromatograms of secondary metabolites of P.igniariusNotes:1,2,3 peaks were secondary metabolites of P.inniarius.

圖5 生物誘導(dǎo)子誘導(dǎo)火木層孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的HPLC圖注：A.SHTD-4；B.HHTD-3；C.HHTD-2；D.SHM-2;1、2、3峰為火木層孔菌次級(jí)代謝產(chǎn)物。Fig.5 HPLC chromatograms of secondary metabolites of P.igniarius induced by biological elicitorNotes:A.SHTD-4；B.HHTD-3；C.HHTD-2；D.SHM-2;1,2,3 peaks were secondary metabolites of P.igniarius.

圖6 phelligridin G對(duì)照品的HPLC圖Fig.6 HPLC chromatogram of reference substance of phelligridin G

圖7 SHM-2誘導(dǎo)火木層孔菌后的質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)注：A.液質(zhì)色譜圖；B.二級(jí)質(zhì)譜圖(負(fù)離子模式)。Fig.7 Mass spectrum and structure of P.igniarius induced by SHM-2Notes：A.chromatogram of HPLC-MS；B.secondary mass spectrum (negative ion mode).

4 討論

桑黃是具有抗腫瘤、提高免疫力等生物活性的藥食兩用真菌，隨著人們對(duì)保健的重視，藥食同源大型真菌的使用率也逐年上升。然而，桑黃的野生資源非常稀少，且栽培時(shí)間較長(zhǎng)[13]，若想使其具有藥用價(jià)值一般需要栽培3年以上。因此，如何獲得與桑黃相似功能的藥用資源是當(dāng)下科研工作需要解決的重要問(wèn)題?；鹉緦涌拙巧｜S的基原菌種之一，其次級(jí)代謝產(chǎn)物包括多糖、倍半萜、三萜及hispidin等成分，與桑黃子實(shí)體的成分相似[6，14]，但在桑黃子實(shí)體中含量較高的hispidin衍生物在火木層孔菌中卻未發(fā)現(xiàn)，hispidin衍生物是桑黃具有抗氧化、抗癌及降血糖等活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[2-5]。因此，如何改變火木層孔菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝途徑、誘導(dǎo)火木層孔菌產(chǎn)生hispidin衍生物，從而能使其從藥用價(jià)值上代替桑黃子實(shí)體值得深入研究。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，利用真菌誘導(dǎo)子和納米粒子等處理植物培養(yǎng)細(xì)胞以促使細(xì)胞快速、大量合成目的次生代謝產(chǎn)物的方法已被人們普遍重視[15-16]。真菌誘導(dǎo)子在植物細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用較多，能顯著提高植物生物堿、紅厚殼素、白藜蘆醇、銀杏內(nèi)酯B[17-19]等多種次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究誘導(dǎo)火木層孔菌產(chǎn)生的phelligridin G是野生桑黃子實(shí)體中含有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)的高度氧化的成分，對(duì)卵巢癌細(xì)胞(A2708)和人結(jié)直腸癌細(xì)胞(HCT-8)有選擇性細(xì)胞毒活性，對(duì)小鼠肝微粒體的脂質(zhì)過(guò)氧化物酶有抑制活性[20]。本研究通過(guò)生物誘導(dǎo)法使火木層孔菌產(chǎn)生原本不能產(chǎn)生的hispidin衍生物phelligridin G，雖然產(chǎn)量低，但可為后續(xù)誘導(dǎo)機(jī)制的研究奠定關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上若能明確產(chǎn)生phelligridin G的關(guān)鍵催化酶，則可使大量生產(chǎn)該化合物成為可能。由此可見(jiàn)，在桑黃野生資源短缺、人工栽培難度大且具有藥用價(jià)值的桑黃生長(zhǎng)年限長(zhǎng)的情況下，生物誘導(dǎo)可為實(shí)現(xiàn)桑黃的資源開(kāi)發(fā)和利用奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。