趙 龍，湯 承，2，岳 華,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041)

牛凸隆病毒(bovine torovirus, BToV)是套式病毒目(Nidovirales)托巴套氏病毒科(Tobaniviridae)凸隆病毒亞科(Torovirinae)凸隆病毒屬(Torovirus)的成員，凸隆病毒屬的成員還包括馬凸隆病毒(equine torovirus, EToV)和豬凸隆病毒(porcine torovirus, PToV)(國際病毒分類委員會：https://talk.ictvonline.org/)。BToV主要引起犢牛腹瀉甚至死亡，同時，也可引起成年牛腹瀉[1-2]。近年來，有學(xué)者從牛呼吸道樣本中檢測到BToV，證明其具有雙重組織嗜性，推測也是潛在的呼吸道致病因子[3-4]。自1982年在美國首次報道以來，目前，世界上已有17個國家報道BToV的存在或流行，其已經(jīng)具有廣泛的地域分布[3-10]。

BToV為有囊膜單股正鏈RNA病毒，目前,GenBank中僅有5條BToV基因組序列，除加拿大BToV基因組為原型毒株Breda 1以外，其余均為基因Ⅱ型毒株。這5條BToV基因組長度為28 297～28 475 bp，基因組由5′UTR和ORF1a、ORF1b、S、M、HE、N6個ORF區(qū)以及3′UTR組成[11]。ORF1a、ORF1b為兩個大的重疊ORF區(qū)，分別編碼聚合酶pp1a和pp1b，在病毒的復(fù)制過程中起著重要作用[11]。S基因編碼纖突蛋白(S蛋白)，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體的重要抗原[12]，并且與病毒的致病性、組織嗜性和宿主范圍密切相關(guān)[13-14]。S蛋白可在“類胰蛋白酶”裂解位點(1 003—1 007 aa)裂解為S1和S2兩個亞基[15-16]，S1亞基負責(zé)與宿主細胞表面的受體結(jié)合，S2亞基則介導(dǎo)病毒與宿主細胞的膜融合，在病毒的感染過程中起著重要作用[17]。M基因編碼的膜蛋白在病毒的組裝、成熟和核衣殼識別過程中起作用[18]。HE基因編碼血凝素酯酶蛋白(HE蛋白)，具有凝集素結(jié)構(gòu)域(R)、酯酶結(jié)構(gòu)域(E)和膜近端結(jié)構(gòu)域(MP)3個結(jié)構(gòu)域[19]。病毒通過HE蛋白實現(xiàn)與唾液酸的可逆性黏附，從而避免由于結(jié)合“假”受體而失去感染力，在啟動感染的初期發(fā)揮重要作用[19]。N基因編碼的核衣殼蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄和翻譯中發(fā)揮作用[18]。

青藏高原的高寒高海拔地理氣候特點孕育了其獨特的生態(tài)系統(tǒng)[20]。牦牛是青藏高原特有物種，全世界約有1 700萬頭牦牛，90%以上的牦牛都分布在我國青藏高原[21]。牦牛腹瀉給牦牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[22]。目前，已知引起牦牛腹瀉的病毒主要有A群牛輪狀病毒(BRV)[23-24]、牛冠狀病毒(BCoV)[25]、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)[26]、紐布病毒(NeV)[27]和星狀病毒(AstV)[22]等，但目前還沒有在牦牛中檢測到BToV的報道。因此，本研究旨在證實青藏高原牦牛BToV的存在并研究其分子特征，為牦牛腹瀉的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

145份3月齡以內(nèi)牦牛腹瀉糞便樣本于2018年5—7月采集于西藏(3個牧場)、青海(3個牧場)、四川藏區(qū)(6個牧場)，樣本凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑及儀器

TrizolTM、pMD19-T克隆載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞等購于寶生物公司；PCR 預(yù)混酶購于TOYOBO公司；1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胰蛋白酶、胎牛血清購自BI公司；HRT-18細胞系由本實驗室保存；凝膠成像系統(tǒng)Doc2000(Bio-Rad公司，美國)；熒光倒置顯微鏡(Olympus Corporation 公司，日本)；基因擴增儀、CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)。

1.3 RNA提取與cDNA合成

取糞便0.2 g與PBS緩沖液(1∶5)混勻后以8 000 r·min-1離心8 min，取上清液400 μL用Trizol 法提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA凍存于-20 ℃待用。

1.4 臨床樣本BToV檢測

采用Ito等[28]的RT-PCR方法進行BToV檢測。PCR陽性產(chǎn)物送生物工程(上海)股份有限公司測序以驗證序列正確性并用于遺傳進化分析。

1.5 病毒的分離培養(yǎng)

參照Aita等[2]的BToV分離培養(yǎng)條件對本研究中BToV陽性樣本進行BToV分離培養(yǎng)。

1.6 陽性樣本中其他腸道病毒共感染調(diào)查

對BToV陽性樣本采用先前報道的方法進一步檢測BRV、BCoV、BVDV 3種病毒的感染情況[23, 29-30]。PCR陽性產(chǎn)物送生物工程(上海)股份有限公司測序以驗證序列正確性。

1.7 基因組擴增

根據(jù)GenBank中現(xiàn)有的5條完整BToV基因組序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計27對引物(表1)，用于擴增基因組序列(包括5′和3′末端序列)，所有BToV陽性樣本均進行全基因組擴增。PCR擴增條件：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系：PCR預(yù)混酶 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補足25 μL。陽性PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收后連接于pMD19-T載體，再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，增菌后送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。對獲得的序列采用SeqMan7.0(version 7.0; DNASTAR, USA)拼接，拼接后的序列進行BLAST比對驗證。再基于拼接后的序列設(shè)計10對引物(表2)，參照上述相同方法進行序列復(fù)核。

表1 BToV基因組序列測定引物信息

表2 BToV基因組復(fù)核引物信息

1.8 序列和遺傳進化及重組分析

使用ORF在線預(yù)測工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測基因組的ORF位置；使用MEGA 7.0.26進行多序列比對，并采用最大似然法建立核苷酸及氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹；使用MegAlign(DNASTAR Inc., WI, USA)計算核苷酸和氨基酸相似性；使用RDP 4.97中的RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法進行重組分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床樣本檢測及病毒分離培養(yǎng)

145份樣本檢出10份BToV陽性，平均陽性率約為6.9%(10/145)。其中，西藏、青海、四川藏區(qū)的陽性率分別約為11.8%(4/34)、8.9%(4/45)、3.0%(2/66)。這10份BToV陽性樣本分別來自4個不同牧場，陽性率分別約為36.4%(4/11)、5.3%(1/19)、2.9%(1/35)、16.0%(4/25)。10份BToV陽性樣本中有5份為BToV單獨感染，3份為BToV與BRV混合感染，1份為BToV與BCoV混合感染，1份為BToV、BRV、BCoV 3種病原混合感染。將10份陽性樣本接種HRT-18細胞系盲傳6代后均無細胞病變產(chǎn)生，并檢測細胞培養(yǎng)物中BToV，無陽性。

2.2 M基因遺傳進化分析

10份BToV陽性PCR產(chǎn)物測序成功(635 bp)(GenBan登錄號：MN882588～MN882597)，其核苷酸相似性為99.7%～100%，與GenBank中已有的13個BToV-M基因片段(≥635 bp)的核苷酸相似性為94.8%～98.6%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究中的10個M基因片段聚為獨立的一支，與荷蘭毒株的親緣關(guān)系最近，與美國毒株親緣關(guān)系最遠(圖1A)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這10個M基因片段與所有13個BToV-M基因片段相比，它們均在138位堿基由T突變?yōu)镃，但該突變并未引起氨基酸改變。

2.3 牦牛源BToV基因組分析

本研究成功從1份西藏陽性樣本中拼接得一條牦牛源BToV基因組，命名為yak-XZ01(GenBank登錄號：MN882587)?；蚪M全長28 314 bp，GC含量為36.31%，由5′UTR和ORF1a、ORF1b、S、M、HE、N6個ORF區(qū)以及3′UTR組成，長度分別為788、13 257、6 870、4 755、702、1 257、492、198 bp(圖2)。該基因組與GenBank中其余5條 BToV基因組相比，核苷酸相似性為82%～97%，與國內(nèi)奶牛源BToV基因組SC2基因組相似性最高(97%)?；贕enBank中已有的5個BToV基因組、7個哺乳動物ToV基因組和yak-XZ01基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BToV yak-XZ01與國內(nèi)奶牛源基因組SC1和SC2共同聚為一支，親緣關(guān)最近，但也有一定的遺傳距離，與澳大利亞毒株親緣關(guān)系最遠(圖1B)。

圈中數(shù)字代表基因組中位置，剩下數(shù)字代表每個基因長度

2.4 BToV yak-XZ01 S基因分子特征

BToV yak-XZ01的S基因全長4 755 bp，編碼1 584個氨基酸。該S基因與GenBank中已有的14條完整BToVS基因的核苷酸相似性為91.4%～97.3%，氨基酸相似性為89.97%～97.85%，與其中的日本毒株AB526863.1氨基酸相似性最高。基于完整S基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BToV yak-XZ01與土耳其毒株MG957145.1共同聚為一支，親緣關(guān)系最近，與美國毒株AF076621.1親緣關(guān)系最遠(圖1C)。進一步分析表明，與GenBank中已有的14條完整BToVS基因序列相比，本研究中的S基因具有8個獨特的氨基酸變異(S35F、T54I、I132V、Q614R、T801I、E885Q、T1 335I、K1 583R)，其中，前6個氨基酸突變位點位于S1區(qū)，后2個氨基酸突變位點位于S2區(qū)。

▲表示本研究中的序列

重組分析表明本研究的S基因發(fā)生區(qū)域重組事件，RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法支持，得分為0.623，重組區(qū)域推測為222—2 473 bp區(qū)間。預(yù)測的主要親本毒株是土耳其MG957146.1，次要親本毒株是日本AB526863.1(圖3A)。

2.5 BToV yak-XZ01 HE基因分子特征

BToV yak-XZ01的HE基因全長1 257 bp，編碼418個氨基酸。該HE基因與GenBank中已有的21條完整BToV-HE基因的核苷酸相似性為71.4%～96.9%，氨基酸相似性為75.7%～96.9%，與其中的荷蘭毒株AJ575380.1氨基酸相似性最高?；谕暾鸋E基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，BToV yak-XZ01株屬于BToV基因Ⅲ型毒株，與土耳其毒株MG957145.1同聚為一支，親緣關(guān)系最近(圖1D)。進一步分析表明，與GenBank中已有的21個完整BToVHE基因序列相比，本研究的HE基因在酯酶結(jié)構(gòu)域具有1個獨特的氨基酸變異(P44S)。

重組分析表明本研究的HE基因發(fā)生點重組事件，RDP、GeneConv、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan、3Seq 7種方法支持，得分為0.453，重組斷點推測位于1 067 bp，預(yù)測的主要親本毒株是美國PToV KM403390.1，次要親本毒株是美國BToV AF076621.1(圖3B)。

圖3 BToV yak-XZ01 S基因(A)、HE基因(B)重組分析

3 討 論

BToV是導(dǎo)致牛腹瀉的一種重要病原[1-2]，目前已有包括中國在內(nèi)的17個國家報道該病毒[3-10]。本研究首次從牦牛中檢測到BToV，陽性樣本來自3個省(區(qū))的4個不同牧場，豐富了牦牛腹瀉病原譜，雖然陽性率不高，但是具有廣泛的地域分布，這與土耳其的報道類似[8]。M基因檢測片段的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，所有牦牛源BToV毒株在遺傳進化樹上單獨聚為一大支，表現(xiàn)出獨特的進化趨勢，提示有必要進一步開展牦牛源BToV的流行病學(xué)調(diào)查。值得注意的是，這10份陽性樣本中有5份存在混合感染，這會增加臨床診斷的困難性，需要引起重視。

本研究從1份西藏陽性樣本中拼接得到1條牦牛源BToV基因組，與GenBank中現(xiàn)有的5條BToV基因組相比，該基因組具有以下4個特點：(1)這是第1個牦牛源BToV基因組；(2)該基因組也是第1個基因Ⅲ型基因組；(3)該基因組的S、HE基因存在重組事件;(4)該基因組的S、HE基因均具有獨特的氨基酸突變。這些發(fā)現(xiàn)對進一步了解BToV的分子特征和遺傳進化具有重要意義。

本研究基因組與國內(nèi)奶牛源基因組SC2同源性最高，親緣關(guān)系最近，這表明牦牛BToV有可能由國內(nèi)奶牛BToV傳播而來。但是，與國內(nèi)奶牛源BToV SC1、SC2相比，牦牛源BToV的各ORF區(qū)域均存在氨基酸變異，這可能是BToV在感染牦牛的過程中對新宿主以及青藏高原環(huán)境適應(yīng)所發(fā)生的變異[31]。本研究的BToV基因組為基因Ⅲ型，而國內(nèi)關(guān)于BToV的分子流行病學(xué)資料較少[9,32]，目前只檢測到基因Ⅱ型的存在，與本研究中BToV的基因型不同。前期研究表明，基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株在荷蘭[33](GenBank登錄號:AJ575380.1)和土耳其(GenBank登錄號MG957145.1、MG957146.1)同時存在流行，因此有必要進一步調(diào)查基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株在我國牛群中的流行情況。

BToV的S蛋白與BCoV類似，該蛋白是引起機體產(chǎn)生中和抗體的重要抗原[12]，并且目前普遍認為S蛋白與病毒的致病性、組織嗜性和宿主范圍的變化有關(guān)[13-14]。在病毒的感染過程中，S蛋白通過“類胰蛋白酶”裂解位點(1 003—1 007aa)裂解為S1和S2兩個亞基[15-16]，S1亞基負責(zé)與宿主細胞表面的受體結(jié)合，S2亞基則介導(dǎo)病毒與宿主細胞的膜融合[17]。本研究的S蛋白上存在8個獨特的氨基酸變異(S35F、T54I、I132V、Q614R、T801I、E885Q、T1 335I、K1 583R)，其中前6個變異位點位于“S1”亞基，后2個變異位點位于“S2”亞基，這可能就會改變病毒與宿主細胞表面受體結(jié)合以及膜融合的能力[34]。然而，目前關(guān)于BToV S蛋白研究資料較少，這些獨特的氨基酸變異的生物學(xué)意義還需要進一步研究。

BCoV的S、HE基因重組事件十分常見[35-36]?；蛑亟M在冠狀病毒的進化中起著重要作用，病毒可通過重組來有效地改變組織嗜性和宿主范圍，從而產(chǎn)生新的致病毒株[37-38]。BToV與BCoV基因組結(jié)構(gòu)相似，兩者S蛋白功能類似[39]。本研究首次報道了凸隆病毒屬成員S基因的區(qū)域重組事件，進一步分析發(fā)現(xiàn)土耳其毒株MG957145.1也具有相同的重組事件。鑒于S基因在病毒的致病性、組織嗜性和宿主范圍上起著重要作用，這種S基因重組毒株的生物學(xué)特性需要進一步研究。

目前，GenBank中有21條完整HE基因序列，根據(jù)BToV-HE基因序列特征可將其劃分為3種基因型[33]，最早發(fā)現(xiàn)的3個BToV毒株均為基因Ⅰ型毒株，來自加拿大[11]、美國[16]和荷蘭(GenBank登錄號: Y10866.1)；基因Ⅱ型毒株共有15個，主要報道于日本[2]、中國[9]和荷蘭[33]等國；基因Ⅲ型毒株共有3個，僅在土耳其(GenBank登錄號MG957145.1)和荷蘭[33]有報道。近年來流行的毒株均為基因Ⅱ型和Ⅲ型毒株。2003年Smits等[33]對GenBank中HE基因進行重組分析，認為基因Ⅱ型毒株是由基因Ⅰ型原型毒株與PToV重組而來，而基因Ⅲ型毒株則被認為是由基因Ⅱ型毒株與一種未知的ToV重組而來。由于該重組分析所用序列都是2003年之前上傳，因此可能由于當時HE基因序列的數(shù)量和年限限制，未能預(yù)測到基因Ⅲ型毒株的親本株。而本研究中HE基因重組事件的親本毒株預(yù)測為美國BToVⅠ型毒株與美國PToV毒株(該序列為2014年上傳)，進一步分析發(fā)現(xiàn)GenBank中已有的3株Ⅲ型毒株也存在相同的重組事件。因此，BToV基因Ⅲ型毒株有可能是由BToVⅠ毒株與PToV毒株重組而來，這對了解Ⅲ型毒株的遺傳進化提供了參考。

HE蛋白的E結(jié)構(gòu)域負責(zé)行使受體破壞酶的功能，從而使病毒能夠可逆地結(jié)合唾液酸[19]。而本研究的HE蛋白在E結(jié)構(gòu)域中的氨基酸突變(P44S)可能會影響HE蛋白的酯酶活性，從而影響病毒對唾液酸的可逆性結(jié)合。R結(jié)構(gòu)域負責(zé)行使受體結(jié)合的功能，相關(guān)的受體結(jié)合位點包括Phe207、Leu170、Leu168、Phe264、Trp109以及形成疏水袋內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的206—213位氨基酸殘基，已有研究證明當受體結(jié)合位點的氨基酸殘基經(jīng)丙氨酸替代可明顯降低HE蛋白與受體結(jié)合的能力[19]。而包括本研究毒株在內(nèi)的所有基因Ⅲ型毒株均在這些關(guān)鍵的結(jié)合位點上有4個氨基酸變異(L170V、W109Y、G210D、T209A)，這些變異可能會直接影響基因Ⅲ型毒株HE蛋白與受體結(jié)合的能力，然而并不是所有的氨基酸突變都是突變?yōu)楸彼?，這些基因Ⅲ型毒株共有的氨基酸突變對受體結(jié)合能力的影響，還需要進一步研究予以證明。

4 結(jié) 論

本研究證實了BToV在牦牛中的存在，豐富了牦牛腹瀉病原譜，為牦牛腹瀉防控提供了參考。獲得了牦牛源BToV基因Ⅲ型基因組，報道了BToV中的S基因重組事件，為進一步研究BToV的流行和遺傳進化提供了參考。