曾宗波，馬旭升，羅志寬，齊亞銀，鄭海學*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原學國家重點實驗室，蘭州 730046)

口蹄疫(FMD)是一種急性、烈性、高度接觸性動物傳染病。FMD主要感染豬、牛、羊等偶蹄動物，臨床以發(fā)熱、口唇、蹄部和乳房形成水泡為特征。FMD的病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)。FMDV是單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒屬(Aphthoviru)的成員。FMDV有7種血清型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、STA3和Asia 1型。FMDV具有高度抗原變異，不同血清型間無抗原交叉保護現(xiàn)象[1]，同時FMDV屬于典型的免疫抑制性病毒，感染宿主以后不僅會產(chǎn)生明顯的免疫抑制反應，還會降低宿主的免疫力，增加宿主感染其他病原的風險[2]。

天然免疫應答反應是宿主抵御外來病原的第一道防線。模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，進而導致Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferons, IFNs)、炎癥因子及其他效應因子產(chǎn)生，最終發(fā)揮抵御外來病原的作用[3]。細胞應答RNA病毒感染時，病毒RNA及病毒復制產(chǎn)生的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)被RIG-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ)和MDA5(melanoma differentiation-associated gene 5)細胞質(zhì)RIG-Ⅰ樣模式識別受體(RLRs)識別[4]，并被招募至定位于線粒體外膜的接頭蛋白VISA(有文獻也叫MAVS、IPS-1、Cardif)[5-9]，一方面VISA激活IKKα/IKKβ激酶復合體，最終釋放NF-κB；另一方面，VISA激活TBK1/Ikk 激酶復合體，進而介導IRF3磷酸化和二聚化，激活的NF-κB和IRF3入核，最終導致Ⅰ型干擾素、炎癥因子產(chǎn)生及下游抗病毒基因表達[10-12]。

多種宿主蛋白通過不同機制調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生在細胞抗FMDV天然免疫應答中發(fā)揮了重要作用。如酯酶D(esterase D，ESD)、膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1, ANXA1)等促進Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，進而抑制FMDV復制[13-14]，DEAD-box RNA解旋酶(DDX56)、多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白2(PCBP2)、G3BP1(Ras GTPase-activating protein-SH3 domain-binding protein 1)抑制Ⅰ型 干擾素產(chǎn)生，進而促進FMDV復制[15-17]。

程序性細胞死亡因子10(programmed cell death factor 10, PDCD10)于1999年在去除了粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子而被誘導凋亡的人髓系細胞系TF-1中克隆得到[18]。PDCD10是一個非常古老的基因，進化過程中高度保守，在人的心、脾、淋巴結(jié)、結(jié)腸等組織細胞中廣泛表達[19]。早期的研究證實PDCD10與細胞調(diào)亡和血管生成密切相關，并作為一個接頭蛋白在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用[20]，且能與眾多的信號蛋白相互作用并形成交互網(wǎng)絡，調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖、極化、遷移和細胞骨架重塑等[21-25]。因此，PDCD10的異常表達可能會造成一個或多個信號通路中斷或紊亂，打破機體細胞增殖與凋亡之間的平衡，但目前未見PDCD10參與調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生及病毒感染之間關系的報道。本研究擬探究PDCD10能否通過干預Ⅰ型干擾素表達進而影響FMDV復制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 HEK-293T細胞、PK-15細胞、仙臺病毒(SeV)、FMDV/O/Mya98/2010毒株均由本實驗室保存。

1.1.2 質(zhì)粒 構(gòu)建豬源pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒，pCAGGs空載體、TK質(zhì)粒、IFN-β報告基因質(zhì)粒、NF-κB報告基因質(zhì)粒、pRK-RIG-I、pRK-MDA5、pRK-VISA、pRK-TBK1、pRK-IRF3等重組質(zhì)粒均由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、opti-MEM 培養(yǎng)基、1%青霉素和鏈霉素溶液、0.25%胰酶溶液均購于GIBICO公司、胎牛血清(Biological Indu)；限制性核酸內(nèi)切酶SmaⅠ和ClaⅠ；總RNA提取試劑盒和質(zhì)粒大提試劑盒均購自Omega公司；反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、RNA 酶抑制劑(RRI)、Oligo(dT)引物、隨機引物、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、大腸桿菌 Trans5α感受態(tài)、TBgreen、ExTaqⅡ、蛋白Marker均購于TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于 Promega 公司；鼠抗myc單抗、鼠抗β-actin單抗均購自Sigma公司；HRP 標記山羊抗鼠IgG 二抗和HRP標記的山羊抗兔IgG二抗均購自中杉金橋公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于 Invitrogen 公司。

1.2 pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒構(gòu)建

參照豬源PDCD10基因序列(NCBI登錄號：XM_013982176.2)，利用Primer Premier5設計擴增引物，分別引入酶切位點SmaⅠ和ClaⅠ。上游引物：5′-ATGAGGATGACAATGGAAGA-3′，下游引物：5′-TCAGGCCACAGTTTTGAAG-3′。提取PK-15細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物克隆于pCAGGs載體上，雙酶切鑒定并測序。

1.3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測

將HEK-293T細胞接種于48孔板中，待細胞長至80%～90% 時，按照 LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，每組試驗設置3個重復，每孔轉(zhuǎn)染螢火蟲熒光素酶報告基因質(zhì)粒4 ng、海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒20 ng和相應的空載體或pCAGGs-PDCD10不同劑量質(zhì)粒(50、100、200 ng)24 h后，SeV感染細胞，12 h后雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測。

1.4 總RNA提取及實時熒光定量PCR

細胞總RNA提取按照Omega試劑盒說明書進行。本研究設置空載體組，空載體SeV感染組，pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒組，pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒SeV感染組。將細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至80%～90%，按照LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染相應的質(zhì)粒18 h后，SeV刺激，收集樣品，提取細胞總RNA，試驗操作過程確保無RNase，RNA提取完成后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR試驗。反應體系：10 μL TB Green，上、下游引物各0.8 μL，0.4 μL ROXII，7.0 μL DEPC 水，1 μL cDNA。反應程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。定量引物詳見表1，引物序列由上海生工公司合成。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

1.5 Western blot

將HEK-293T細胞接種于60 mm 培養(yǎng)皿中，待細胞長到80%～90% 時，根據(jù)試驗要求按照LipofectamineTM2000說明書瞬時轉(zhuǎn)染pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒以及pCAGGs空載體質(zhì)粒，收集細胞，處理樣品，100 ℃變性10 min。蛋白上樣跑SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗，TBST 洗膜5次，每次 5 min，室溫孵育二抗1 h，TBST 洗膜5次，每次5 min，加入ECL發(fā)光液顯色曝光。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用 2-△△Ct分析方法計算不同試驗的數(shù)值，計算后的數(shù)據(jù)用 GraphPad Prism 5進行分析，運用單因素方差分析法，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒酶切鑒定及表達驗證

為判斷pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒是否構(gòu)建正確，SmaⅠ和ClaⅠ雙酶切后，瓊脂凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1a所示，在639 bp見PDCD10條帶，在5 000 bp 見空載體條帶。經(jīng)測序后確定該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將成功構(gòu)建的 pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞24 h后，處理樣品并進行Western blot試驗，結(jié)果如圖1b所示，表明PDCD10重組質(zhì)粒在HEK-293T細胞中表達。

a.重組質(zhì)粒酶切鑒定(M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1.PDCD10基因擴增產(chǎn)物；2.pCAGGs-PDCD10重組質(zhì)粒ClaⅠ和 SmaⅠ雙酶切產(chǎn)物)；b.PDCD10-Myc在HEK-293T細胞中表達

2.2 過表達PDCD10促進FMDV復制

為確定PDCD10對FMDV復制的影響，在PK-15 細胞中，本研究設置試驗組和對照組，分別轉(zhuǎn)染PDCD10重組質(zhì)粒和空載體18 h后，感染FMDV，設置不同時間點，收集細胞提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qPCR試驗和Western blot試驗，在mRNA水平和蛋白水平分別驗證PDCD10對FMDV復制的影響，結(jié)果如圖2所示，表明在mRNA水平和蛋白水平，PDCD10均顯著促進FMDV復制。

a.qPCR檢測過表達PDCD10不同時間點FMDV的復制，****.P<0.000 1; b.Western blot檢測過表達PDCD10不同時間點FMDV的復制。EV.空載體(下圖同)

2.3 沉默PDCD10抑制FMDV復制

為進一步確定PDCD10對FMDV復制的影響。本研究設計了3條靶向PDCD10的siRNA，將3條siRNA分別轉(zhuǎn)染PK-15細胞，終濃度為100 nmol·L-1，24 h后qPCR檢測，沉默效率如圖3a所示，表明3條siRNA均能顯著降低PDCD10基因轉(zhuǎn)錄。進而選擇沉默效果最好的第3號siRNA進行后續(xù)試驗，其序列：5′-CAUGUAUCCUGUGUUUAAUTT-3′，將該siRNA轉(zhuǎn)染PK-15細胞18 h 后，感染FMDV(MOI=1)，再經(jīng)過12 h qPCR檢測FMDV的復制，結(jié)果如圖3 b所示，表明沉默PDCD10能顯著降低FMDV的復制。

a.PK-15中PDCD10沉默效率鑒定；b.qPCR檢測沉默PDCD10后對PK-15中FMDV復制的影響；*.0.01

2.4 PDCD10促進FMDV復制與Ⅰ-IFN相關

由RLRs介導的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生對機體抵御病毒入侵具有十分重要的作用，為探究PDCD10促進FMDV復制與Ⅰ型干擾素之間的相關性。首先，用IFN-β刺激PK-15細胞，4 h后感染FMDV(MOI=1)，12 h后qPCR檢測FMDV的復制，結(jié)果如圖4a所示，與對照相比，IFN-β能顯著抑制FMDV的復制。其次，過表達PDCD10后感染SeV(MOI=1)12 h,收集上清液，并將上清液加到PK-15細胞中，4 h后感染FMDV(MOI=1)，再經(jīng)過12 h qPCR檢測FMDV的復制，結(jié)果如圖4 b所示，與空載體組相比，過表達PDCD10的上清液能顯著促進FMDV的復制。

a.用IFN-β處理或不處理PK-15細胞，qPCR檢測FMDV的復制情況；b.過表達PDCD10并感染SeV，取上清處理PK-15細胞，qPCR檢測FMDV的復制情況；*.0.01

2.5 PDCD10抑制IFN-β啟動子和NF-κB激活

為進一步探究PDCD10如何影響FMDV的復制。本文探究了PDCD10是否影響病毒感染誘導的IFN-β啟動子激活，分別將pCAGGS-PDCD10重組質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒以及空載體轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞18 h 后，感染SeV(MOI=1)，再經(jīng)過12 h 處理樣品，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測，結(jié)果如圖5所示，表明PDCD10可顯著抑制SeV誘導的IFN-β啟動子和NF-κB的激活，且呈劑量依賴性。

圖5 PDCD10抑制SeV誘導的IFN-β和NF-κB激活

接著，為確定PDCD10抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子水平，本研究設置試驗組和對照組，分別瞬時轉(zhuǎn)染PDCD10質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒和Ⅰ型干擾素通路分子質(zhì)粒，雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測，結(jié)果如圖6所示，表明PDCD10分別抑制RIG-I、IRF3、IRF7誘導的IFN-β啟動子激活，但是PDCD10不能抑制VISA、MITA、TBK1誘導的IFN-β啟動子激活。

a～f.將Ⅰ型干擾素通路分子質(zhì)粒分別與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞18 h 后，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測IFN-β的激活情況；*.0.01

2.6 PDCD10負調(diào)控RLRs通路分子的表達

為研究PDCD10對Ⅰ型干擾素信號通路分子轉(zhuǎn)錄水平的影響，本研究設置試驗組和對照組，分別將pCAGGS-PDCD10重組質(zhì)粒和空載體瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞18 h 后，感染SeV(MOI=1)，再經(jīng)過12 h 收集樣品，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行實時實熒光定量PCR試驗，結(jié)果如圖7所示，表明感染SeV后，試驗組的RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1的轉(zhuǎn)錄顯著低于相應的對照組，但對IRF3和STING的轉(zhuǎn)錄沒有影響。

a～f.HEK-293T細胞中過表達PDCD10，感染或不感染SeV 18 h 后，qPCR分別檢測通路分子基因的表達；*.0.01

2.7 PDCD10負調(diào)控Ⅰ型干擾素下游ISGs的轉(zhuǎn)錄

為探究PDCD10對Ⅰ型干擾素下游ISGs轉(zhuǎn)錄水平的影響。本研究設置試驗組和對照組，在HEK-293T細胞中分別轉(zhuǎn)染pCAGGS-PDCD10重組質(zhì)粒和空載體18 h 后，感染SeV(MOI=1)，再經(jīng)過24 h，收集樣品，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qPCR試驗，結(jié)果如圖8所示，表明感染SeV后，試驗組的ISG20、ISG54、ISG56、CXCL10、RANTES的轉(zhuǎn)錄顯著低于相應的對照組。

a～f.HEK-293T細胞中過表達PDCD10，感染或不感染SeV 18 h 后，qPCR分別檢測Ⅰ-IFN下游ISGs的表達；*.0.01

3 討 論

天然免疫是宿主抗病毒應答的第一道防線，一旦RNA病毒感染，模式識別受體RLRs識別病毒核酸，并與線粒體上的VISA結(jié)合，活化后的VISA招募TBK1與IKK激酶復合物，使得IRF3發(fā)生磷酸化并形成二聚體并入核，最終導致Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。Ⅰ型干擾素介導的干擾素刺激基因表達對宿主細胞清除外來病毒感染中具有十分重要的作用。適時、適量的Ⅰ型干擾素產(chǎn)生能有效抑制病毒復制，并誘導適應性免疫應答，最終免疫系統(tǒng)清除病毒[3],相反，Ⅰ型干擾素產(chǎn)生過量，會誘發(fā)自身免疫性疾病，甚至導致機體死亡[26]。由于不受控制的先天免疫反應對宿主是有害的，甚至是致命的，因此，宿主蛋白對于Ⅰ型干擾素信號通路的精準調(diào)控對于維持宿主的免疫平衡至關重要。近年來，研究證實許多正負調(diào)節(jié)因子通過不同的機制在多個水平上控制著先天性免疫信號通路。如當病毒感染后，研究表明，HAUS-augmin樣復合物亞基8(HAUS8)通過靶向VISA復合物增強RLR-VISA依賴的抗病毒信號通路[27]。E3連接酶RIPLET結(jié)合多聚化的RIG-Ⅰ正調(diào)控RIG-Ⅰ，使得RIG-Ⅰ形成穩(wěn)定的四聚體，最終與VISA結(jié)合[28]。相對于宿主蛋白正調(diào)控，當RNA病毒感染宿主細胞后，RIG-Ⅰ在第8個絲氨酸位點會發(fā)生磷酸化，但該位點的磷酸化可阻斷E3泛素連接酶TRIM25對RIG-Ⅰ的泛素化修飾，從而負調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[29]；磷酸酶PPM1B可以催化TBK1去除其172位絲氨酸的磷酸化修飾，負調(diào)控TBK1激活，從而抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[30]；此外，E3泛素連接酶RNF5可以催化VISA或MITA發(fā)生K48連接的多聚泛素化修飾并通過蛋白酶體途徑被降解，從而負調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[31-32]；AIP4能夠催化VISA發(fā)生泛素化修飾進而被降解，負調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生[33]；ISG56是一種干擾素誘導蛋白，病毒刺激細胞以后，會產(chǎn)生大量的ISG56，但ISG56會破壞VISA與MITA復合物的組裝，從而負調(diào)控IRF3的激活[34]。本研究發(fā)現(xiàn)宿主蛋白PDCD10能夠顯著抑制由SeV誘導的IFN-β和NF-κB的激活且呈劑量依賴性，并且在mRNA水平顯著抑制Ⅰ型干擾素信號通路關鍵分子RIG-Ⅰ、MDA5、VISA和TBK1轉(zhuǎn)錄，導致Ⅰ型干擾素產(chǎn)生水平降低。同時對下游ISGs的研究發(fā)現(xiàn)，PDCD10顯著抑制ISG20、ISG54、ISG56、CXCL10、RANTES等抗病毒基因轉(zhuǎn)錄，抗病毒基因由Ⅰ型干擾素調(diào)控表達，進一步說明PDCD10對Ⅰ型干擾素表達起負調(diào)控作用。雙熒光素酶報告基因試驗中，發(fā)現(xiàn)PDCD10能夠抑制RIG-Ⅰ介導的干擾素的活化，但對其下游VISA介導的干擾素的活化沒有影響，這間接說明PDCD10影響VISA上游的信號分子，如RIG-Ⅰ。同時PDCD10對于IRF3以及IRF7誘導的干擾素的表達也具有抑制作用，這說明在IRF3或IRF7分子水平，PDCD10也具有抑制功能。結(jié)合上述結(jié)果，PDCD10可能不僅僅定位于RLRs通路中的一個分子。目前，研究證實，PDCD10在不同種屬間保守，在不同臟器中均有表達。同時，當病毒或細菌感染后，檢測發(fā)現(xiàn)不同組織中PDCD10均有上調(diào),高致病性H5N1禽流感病毒感染雞胚成纖維細胞發(fā)現(xiàn)免疫相關基因PDCD10表達上調(diào)[35]。但PDCD10抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生是首次被報道，PDCD10抑制Ⅰ型干擾素的具體分子機制仍有待進一步研究。

研究報道顯示，Ⅰ型干擾素能夠抑制FMDV的復制。本研究發(fā)現(xiàn)PDCD10能夠促進FMDV復制，推測這與干擾素的合成具有相關性。因此通過與對照組相比，IFN-β刺激后的細胞能夠顯著抑制FMDV的復制，這與之前的研究相符[36]。同時，為了證實PDCD10介導Ⅰ型干擾素的降低，促進FMDV復制。本研究利用過表達PDCD10后，SeV刺激的細胞上清處理PK-15細胞，感染FDMV，結(jié)果顯示FMDV復制增加。這進一步說明PDCD10能夠通過抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，進而促進FMDV復制。因此，本文為認識宿主蛋白正向調(diào)控FMDV復制提供了新視角，但是其具體機制仍有待下一步研究。

4 結(jié) 論

宿主蛋白PDCD10負調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，而促進FMDV復制，本研究為進一步探究PDCD10調(diào)控宿主抗病毒天然免疫的機制奠定了基礎。