熊顯榮，張 雁，熊 燕，閔星宇，吳錦波，郝振宇，張 賀，李 鍵*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用國家教育部重點實驗室，成都 610041；3.四川省阿壩州畜牧科學(xué)研究所, 阿壩 623000)

牦牛(Bosgrunniens)主要分布于青藏高原及毗鄰高海拔地區(qū)，有“高原之舟”的稱號?，F(xiàn)有牦牛1 400多萬頭，其中，90%以上分布在我國境內(nèi)。牦牛是青藏高原牧民賴以生存的必要物種，在嚴峻的自然生長條件下，為牧民提供了維持生產(chǎn)、生活等的必需品，如肉、乳、毛、皮等[1]。但是，牦牛的繁殖能力偏弱、生產(chǎn)性能低下、生長速度緩慢。青藏高原牧區(qū)生產(chǎn)方式比較落后，牦牛近親繁殖的現(xiàn)象嚴重，許多品種逐漸出現(xiàn)退化。因其畜群周轉(zhuǎn)的速度變慢，嚴重影響了牦牛群體的生產(chǎn)力水平。長期以來，牧民的不合理選種和繁育，導(dǎo)致畜群平均生產(chǎn)力極度下降、受胎率低、繁殖力下降，畜群結(jié)構(gòu)極其不合理[2]。此外，不同區(qū)域牦牛的用途存在一定差異，有些區(qū)域以乳用為主，期望群體中雌性個體為主導(dǎo)；有些區(qū)域以肉用為主，期望群體中雄性個體為主導(dǎo)。由此可見，以實際生產(chǎn)需求為導(dǎo)向，開展牦牛的性別控制意義重大，能顯著提升牦牛的繁殖效率和市場價值。

性別控制技術(shù)可根據(jù)生產(chǎn)需求獲得不同性別的后代。目前，效果最好且廣泛應(yīng)用的分離方法是流式細胞儀分選法[3]。流式細胞儀分離X、Y精子的本質(zhì)是根據(jù)精子大小以及物理或化學(xué)性質(zhì)進行的篩選[4]。由于X、Y精子的DNA含量存在差異，使之結(jié)合不同量的熒光染料Hoechst33342，當(dāng)精子順次排列通過流式細胞儀檢測時，精子頭部所攜帶的熒光染料被激發(fā)光束激發(fā)產(chǎn)生熒光，X精子結(jié)合的熒光染料較多，流式細胞儀為X、Y精子加上正電荷或負電荷，根據(jù)電荷的正負把X、Y精子分開[5]。Bathgate等[6]利用流式細胞儀分離羊X、Y精子，得到了羊的性控精液。Sales等[7]利用流式細胞儀分離牛X、Y精子，采用人工授精技術(shù)檢測分離精子的純度，X精子受精后母犢的產(chǎn)出率為83%，Y精子受精后公犢產(chǎn)出率為90%。隨著技術(shù)的進步，利用流式細胞儀分離精子的方法已經(jīng)被多個國家商業(yè)化應(yīng)用。但這項技術(shù)也存在分離效率低、分離成本高、受胎率偏低等問題。利用流式細胞儀分離精子時會浪費掉大量精子[8]，其中包括多個方面的因素：分離過程中約有30%的精子因為不準確的定向無法產(chǎn)生正常的熒光信號而被丟棄；約有15%的精子因為 X、Y精子的信號峰之間可能會產(chǎn)生重疊，不能準確地區(qū)分而被棄；精子分離的各個步驟中也會造成15%～20%的損失[9]。這些因素都造成了分離精子效率較低，同時會在分離過程中浪費部分優(yōu)質(zhì)精子。此外，許多研究表明，分離精子的受胎率低于普通精液，可能原因是分離、冷凍等過程會對精子造成一定的損傷，影響精子受精的能力[9-10]。

因此，如何提高流式細胞儀分離精子的效率、減少分離精子的浪費、提高分選后精子的活力等，對推廣性控精液具有重要的意義。食物色素誘惑紅屬于單偶氮染料，由6-羥基-5-(2-甲氧基-5-甲基-4-磺酸鹽-苯偶氮)-2-萘磺酸鹽組成。它以暗紅色粉末或顆粒的形式存在，易溶于水，被廣泛應(yīng)用于食品著色。低濃度誘惑紅(<1.25 mg·L-1)對細胞無顯著毒性，且無法進入細胞膜完整的細胞。本試驗以流式細胞儀分選牦牛X、Y精子為基礎(chǔ)，優(yōu)化并建立高效的分選體系。通過添加誘惑紅染料，與Hoechst33342共孵育精子細胞，顯著提高了分選的效率。借助分子生物學(xué)技術(shù)對分選純度進行鑒定，并結(jié)合體外受精技術(shù)，對分選后的X、Y精子分別進行受精，檢測分選后的精子活力及進一步鑒定分選的純度。本研究建立了一套高效的分選技術(shù)體系，為后期牦牛性控精液的制備及生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：流式細胞分選儀(MoFlo XDP，美國)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，PCR儀(Eppendorf，德國)，熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國)，倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，精子分析系統(tǒng)(AndroVision，德國)。主要試劑：DNATaq聚合酶和DNA Marker均購自北京天根有限公司，熒光染料Hoechest33342(Sigma，美國)、誘惑紅(Sigma，美國)、體外受精及胚胎培養(yǎng)液均購自Vitrolife公司(瑞典)。

1.2 精子細胞懸液的制備

本研究采用商品化牦牛凍精，將精液冷凍細管放入42 ℃恒溫水浴中解凍30 s，用PBS稀釋精液，400目濾器過濾。用Falcon管預(yù)先裝入精子稀釋液，使精子終濃度約為1.5×108個·mL-1。加入不同量(10 μL和20 μL)染色液(5 g·L-1Hoechest33342)，用移液器輕輕吹打均勻，在溫度38.5 ℃、CO2濃度為5.5%、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 流式細胞儀分選精子

本試驗采用貝克曼流式細胞儀MoFlo XDP進行分選，所有分選步驟均嚴格遵守?zé)o菌操作。選用70 μm噴嘴，鞘液壓力60 psi，分選流速控制在1×104個·s-1。將預(yù)先染色的精子樣品放入進樣倉，當(dāng)X精子峰和Y精子峰在FL2通道的變異系數(shù)(CV值)小于2%時，開始精子分選。分別接收1×107個X、Y精子，將精子接收管取出放入38.5 ℃的CO2培養(yǎng)箱中備用。

1.4 單精子PCR擴增鑒定

分選所得的X、Y精子在顯微鏡下分離，分別隨機各取50個，將單個精子加入1 μL堿性裂解液(500 mmol·L-1KOH，125 mmol·L-1DTT)中，置于65 ℃的水浴中裂解10 min，再加入10 μL的中和液(900 mmol·L-1Tris·HCl)混合均勻，即完成了基因組裂解及DNA提取，以雌、雄牦牛血液DNA為對照組。參考GenBank中已經(jīng)公布普通牛(Bostaurus)的SRY及GAPDH基因序列，通過Premier 5.0軟件設(shè)計引物，具體引物信息見表1。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。PCR反應(yīng)體系為15 μL：模板1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，Premix TaqTMDNA聚合酶7.5 μL，ddH2O 4.5 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用2%瓊脂糖凝膠進行PCR電泳檢測。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.5 精子活力檢測

精子的活力決定受精率，對分選的牦牛X、Y性控精子進行活力檢測，與分選前的精子比較，判定分選對精子活力的影響。從液氮罐中取出未分選的牦牛性控精液，在42 ℃恒溫水浴鍋中解凍，將精液從凍精細管中轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，放置于38.5 ℃的CO2培養(yǎng)箱中平衡5 min。顯微鏡加熱板開啟預(yù)熱，用移液器從平衡后的精液中取10 μL精液滴于載玻片，蓋上蓋玻片，置于精子分析系統(tǒng)下檢測，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計精子活力。

1.6 誘惑紅孵育精子細胞

精子懸浮液的制備同上，染色液Hoechest33342與5 μmol·L-1的誘惑紅在38.5 ℃、CO2濃度為5.5%，飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中共孵育。1 000 r ·min-1離心收集精子細胞，PBS 洗滌3次。用稀釋液進行精子稀釋，采用步驟“1.3”優(yōu)化的分選條件進行X、Y精子分選。分選后用PCR技術(shù)檢測分選精子的純度，精子分析系統(tǒng)檢測分選后精子的活力。

1.7 分選后精子的體外受精

牦牛卵母細胞收集及體外培養(yǎng)方法參考文獻[2]。將成熟的COCs轉(zhuǎn)移至預(yù)平衡的G-IVF清洗微滴中，清洗2～3次，然后，轉(zhuǎn)移至預(yù)平衡的G-IVF 受精微滴(50 μL)中培養(yǎng)，每個受精微滴放置20～30枚COCs。采用上游法精子獲能，將分選后的X、Y精子移入盛有預(yù)平衡的精子獲能液的底部，置于CO2培養(yǎng)箱中獲能40～50 min。獲能后取適量上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，1 500 r ·min-1離心5 min 后棄上清，吹打混勻底部剩余的50 μL液體。將適量精子加入放置有COCs的G-IVF受精微滴中，精子濃度約為1×104個·mL-1，隨后轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱中。共孵育20 h后，撿出受精的卵母細胞，轉(zhuǎn)移至預(yù)平衡的G-1微滴(50 μL)中培養(yǎng)。每個微滴放置10～20枚卵母細胞，放置于38 ℃、CO2濃度為5.5%、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后換液。培養(yǎng)24與168 h后分別觀察并統(tǒng)計卵裂率和囊胚形成率。

1.8 胚胎性別鑒定

收集各組囊胚期的胚胎，胚胎基因組的提取及PCR反應(yīng)參照“1.4”。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，統(tǒng)計各組胚胎的性別結(jié)果。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有組別的試驗至少重復(fù) 3次，SPSS 19.0 進行ONE-WAY ANOVA 檢驗，用SSR法進行多重比較，P<0.05認為差異顯著，P<0.01認為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)化牦牛X、Y精子的分選條件

檢測不同染色時間、不同染色液用量對牦牛精子分選的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)Hoechest33342染色液濃度為5 g·L-1、精子染色時間為40 min、染色液用量10 μL時，X、Y區(qū)域占有比例最佳，形成兩個明顯的峰(圖1中藍色峰)。此外，由表2可知，用10 μL Hoechest33342染色40 min的精子回收效率最高，精子活力與20 μL Hoechest33342染色20 min組相當(dāng)，顯著高于其他組(P<0.05)。

H為Hoechest33342，T為染色時間。FL2為Hoechest33342染色后水平角度(0度)的信號值，F(xiàn)L4為Hoechest33342染色后垂直角度(90度)的信號值。紅色為細胞散點圖，顏色越深，代表細胞數(shù)量越多；藍色為分選峰值圖，出現(xiàn)兩個峰(即X、Y峰)，兩個峰越明顯，分選效果越好

表2 Hoechest33342染色液用量和染色時間對精子分選回收率及活力的影響

2.2 單精子性別鑒定

對分選后的牦牛X、Y精子進行單精子裂解，提取總DNA，應(yīng)用Y染色體特異基因SRY的引物檢測精子的性別，電泳結(jié)果見圖2。Y精子出現(xiàn)294 和208 bp兩條特異性條帶，而X精子只有唯一的208 bp條帶。根據(jù)電泳結(jié)果，統(tǒng)計分選后精子的純度，結(jié)果見表3。

表3 分選后牦牛X、Y單精子PCR擴增統(tǒng)計結(jié)果

1～5.分選后Y精子；6～10.分選后X精子；M.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準；11～12.公牦牛血液DNA；13～14.母牛血液DNA；15.陰性對照組

2.3 誘惑紅對精子活力的影響

隨機抽取分選后牦牛X、Y精子及未分選精子，進行活力檢測(圖3)。結(jié)果顯示，未添加誘惑紅處理的精子，通過分選后得到的X和Y精子，其精子活力顯著低于分選前的精子(P<0.05)。添加5 μmol·L-1誘惑紅與Hoechest33342共同孵育精子細胞，顯著提高了精子的活力，與分選前精子活力無顯著差異(P>0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 分選后X、Y精子的發(fā)育潛能

根據(jù)試驗設(shè)計，連續(xù)采集3次牦牛卵巢，將每次收集得到的卵母細胞隨機分成3組，分別用分選后的X精子、分選后的Y精子和未分選的精子受精，記錄受精率和胚胎發(fā)育結(jié)果(表4)。結(jié)果顯示，分選后的X與Y精子組的受精率及囊胚形成率略低于未分選組，但差異不顯著(P>0.05)。利用已優(yōu)化的PCR擴增體系對各組胚胎性別進行鑒定，結(jié)果顯示，各組的胚胎性別與精子純度基本吻合。

表4 精子發(fā)育潛能統(tǒng)計結(jié)果

3 討 論

經(jīng)濟動物性別的控制與畜牧業(yè)的發(fā)展有著密不可分的關(guān)系，是長期以來科研人員的研究焦點之一[11]。目前，利用性控精液進行人工授精和性控胚胎生產(chǎn)，是比較有效的控制方法[12]。通過此項技術(shù)，可以滿足正常的畜牧生產(chǎn)需要，有效地提高生產(chǎn)效益[13]。本研究利用流式細胞儀進行牦牛X、Y精子分離，優(yōu)化并建立了一套高效的分選技術(shù)體系。運用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測了分選后精子及胚胎的性別，進一步驗證了分選的效率與純度。本研究通過添加誘惑紅，與Hoechest33342共孵育精子細胞，能顯著提高分選后的精子活力。

染料孵育是精子分選的一個重要技術(shù)環(huán)節(jié)[14-15]。最常用的染色劑為Hochest33342，這種染料可以穿透細胞質(zhì)膜且具有水溶性質(zhì)，采用非嵌入方式與DNA雙鏈上的小溝結(jié)合后，最大激發(fā)波長為350 nm[16]。然而，同一物種的不同細胞類型或不同物種的相同細胞類型對Hochest33342的耐受性存在一定差異。用16.2 mmol·L-1的Hochest33342孵育馬的精子90 min，其分選后精子的活力和分選效率最佳[17]。Clulow等[18]利用Hochest3334染色馬的精液，使其終濃度為55～90 μmol·L-1，顯著提高了分選效果及分選后精子的抗凍能力。曾有權(quán)等[19]用5 g·L-1Hochest3334和25 g·L-1食物色素處理豬精子約30 min，對分選后的精子進行人工授精，X精液產(chǎn)雌性率91.67%，Y精液產(chǎn)雄性率100%。在其他哺乳動物的精子分選中也發(fā)現(xiàn)Hoechst33342的最適濃度有一定差異，且分選后的后代動物會出現(xiàn)一些異常[20]。盡管有關(guān)細胞毒性或由Hoechst33342染色精子導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常的報道較少，但是精子暴露在Hoechst33342 中的遺傳毒性效應(yīng)已達成共識。本研究采用5 g·L-1Hoechest33342染色液10 μL孵育牦牛精子細胞40 min后，其分選效果最佳。此外，本研究在精子分選前用食物色素誘惑紅與Hoechest33342 共孵育牦牛精子細胞。誘惑紅只著色因膜破損的精子，將Hoechest33342熒光信號掩蓋，導(dǎo)致激發(fā)光減弱，使該部分精子在分選時被廢棄[3, 21]。只有膜完整的精子才進入分離程序，可以顯著提高分選后有活力精子的比例。

用于評價精子分離后純度及活力的方法較多，有出生后代的性別比例鑒定法、胚胎性別鑒定評價法、流式細胞儀重分析評價法、FISH法與PCR評價法等[22-23]。Fugger等[15]研究表明，利用流式細胞儀分選人的X、Y精子并用于體外受精，統(tǒng)計其后代的性別，其中X精子受精所產(chǎn)后代女性占92.9%，Y精 子受精所產(chǎn)后代男性占73%。Johnson[22]利用流式細胞儀分選豬精液，得到的性控精液用于人工受精，其所產(chǎn)后代母豬比例占74%，公豬比例占83%。此方法存在試驗周期長，不能及時對結(jié)果優(yōu)化的問題[24]。用胚胎性別鑒定來評價精子分離的純度，此方法準確度較高，許多試驗均采取這種方法來評價精子分選的純度[25]。Monk和Handyside[26]用胚胎細胞學(xué)評價鼠的性別控制，結(jié)果顯示，雌鼠準確率為91%，雄鼠準確率為100%。但因顯微切割的要求較高，不宜推廣使用[27]。胚胎分子生物學(xué)評價法依據(jù)對胚胎細胞中的Y染色體上特有的SRY性別基因的檢測，以評價分選精子的純度[28]。檢測到特異信號的判定為雄性，未檢測到特異信號的則判定為雌性[29-30]。此方法具有敏感、準確、快速等特點，是目前最常見的方法之一[31-34]。本研究中，采用單精子PCR法對分選精子進行了純度分析，結(jié)果顯示，X精子純度率為94%，Y精子純度率為96%。為進一步驗證分選后精子的活力，將分選后的精子進行體外受精，結(jié)果顯示，分選前后牦牛精子的發(fā)育潛能差異不顯著，且胚胎的性別與期望值基本吻合，表明所建立的流式細胞儀分選體系可靠。

4 結(jié) 論

本研究通過流式細胞分選儀成功建立了高效的牦牛X、Y精子分選體系。分選后的X、Y精子純度可達94%以上，分選后精子活力達到54%。本研究對牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義，尤其是為后期牦牛的性控精液制備及生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。