桂 馨， 石嘉豪， 汪貴英， 邢麗波， 陸東東

（同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海200092）

0 引 言

分子生物學(xué)是從分子水平研究核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及其在生命現(xiàn)象中體現(xiàn)的重要性和規(guī)律性的科學(xué)，是一門實(shí)驗(yàn)性極強(qiáng)的學(xué)科，其理論與實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)滲透到生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域［1-3］。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)作為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)專業(yè)重要的實(shí)驗(yàn)課之一，在我國多數(shù)學(xué)校均作為一門必修課程。我院將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作作為本科生畢業(yè)技能考核的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，多年來分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課時安排為每屆本科生34 學(xué)時，共包括6 個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，項(xiàng)目設(shè)計(jì)從簡單的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)到綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)層層深入［4］。近年來結(jié)合本學(xué)科的發(fā)展對實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行了調(diào)整，設(shè)計(jì)了“通過報告基因檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平變化”“哺乳動物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染”等實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。其中尤以“報告基因檢測”實(shí)驗(yàn)較為復(fù)雜，難度較高，該實(shí)驗(yàn)涉及報告基因載體質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞報告基因轉(zhuǎn)染、報告基因表達(dá)產(chǎn)物鑒定等多個環(huán)節(jié)［5］。特別是本實(shí)驗(yàn)中接觸到多種實(shí)驗(yàn)技能，如細(xì)胞培養(yǎng)的無菌操作技術(shù)、細(xì)胞傳代培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、質(zhì)粒的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)、蛋白濃度測定方法、報告基因的檢測技術(shù)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等。

然而，由于實(shí)驗(yàn)學(xué)時和操作時間的限制，學(xué)生要參與所有過程是困難的，所以大部分實(shí)驗(yàn)由教師提前準(zhǔn)備，學(xué)生僅完成課堂實(shí)驗(yàn)部分內(nèi)容，幾乎達(dá)不到整個實(shí)驗(yàn)的50%教學(xué)內(nèi)容。為了讓學(xué)生能夠得到更多的實(shí)驗(yàn)技能訓(xùn)練和了解整個實(shí)驗(yàn)的技術(shù)路線，從拓展實(shí)驗(yàn)教學(xué)的角度出發(fā)，以“報告基因檢測”實(shí)驗(yàn)為例，讓學(xué)生參與到整個實(shí)驗(yàn)過程，從而培養(yǎng)學(xué)生的操作技能和研究思維能力［6］。

我院從以下幾方面對實(shí)驗(yàn)教學(xué)進(jìn)行了探索，通過建立精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，力求以點(diǎn)帶面將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)打造成實(shí)驗(yàn)“金課”［7］。

1 開放實(shí)驗(yàn)室，讓學(xué)生全過程參與實(shí)驗(yàn)操作

鑒于原有的實(shí)驗(yàn)過程受實(shí)驗(yàn)學(xué)時的限制，學(xué)生只能操作其中的幾個步驟，隨著學(xué)校大力提倡在課余時間給本科生開放實(shí)驗(yàn)室，為了讓學(xué)生有更多的時間參與到完整的實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，引導(dǎo)學(xué)生在課余時間系統(tǒng)掌握實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容［8］，利用教學(xué)實(shí)驗(yàn)室的開放機(jī)制，讓學(xué)生利用課余時間進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，在老師的指導(dǎo)下完成所有的實(shí)驗(yàn)過程［9-10］，增加學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作的機(jī)會，增強(qiáng)學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作技能，牢固掌握相關(guān)的實(shí)驗(yàn)原理。

實(shí)驗(yàn)室開放前，僅對“報告基因的測定和統(tǒng)計(jì)分析”實(shí)驗(yàn)規(guī)定由學(xué)生操作，其他如細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞計(jì)數(shù)、報告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染效率的分析、細(xì)胞激活劑處理、報告基因的測定和統(tǒng)計(jì)分析等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)基本都由教師操作，改進(jìn)后所有實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)均由學(xué)生操作。

學(xué)生通過親自參與各個實(shí)驗(yàn)步驟，掌握實(shí)驗(yàn)操作的每個細(xì)節(jié)，拓展了學(xué)生的操作技能。對于“報告基因檢測”實(shí)驗(yàn)，還進(jìn)行了如下的改進(jìn)：① 課堂教學(xué)前1周，開始進(jìn)行教學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的訓(xùn)練（建立無菌操作觀念，掌握包括滅菌、細(xì)胞傳代培養(yǎng)等）。②課堂教學(xué)前兩天，對實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)及分組（掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)方法及稀釋方法）。③ 課堂教學(xué)前1 天，對實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞進(jìn)行報告基因質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染（需耗時6 h）（掌握質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的技術(shù)）。④課堂教學(xué)當(dāng)日清晨，讓學(xué)生親自加入激活劑。⑤ 課堂教學(xué)課上進(jìn)行報告基因的測定和統(tǒng)計(jì)分析并完成實(shí)驗(yàn)報告。

通過這樣的實(shí)驗(yàn)安排，使學(xué)生對實(shí)驗(yàn)室過程有了充分的了解。①原來學(xué)生沒有掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對細(xì)胞的狀態(tài)、培養(yǎng)基的使用等沒有感性認(rèn)識，通過試驗(yàn)后，學(xué)生能正確配制細(xì)胞培養(yǎng)液，對細(xì)胞生長的健康狀況有了初步的直觀認(rèn)知和判斷，加深了細(xì)胞培養(yǎng)無菌操作的理念理解，熟悉了細(xì)胞傳代培養(yǎng)的每個步驟。②原來學(xué)生對于報告基因檢測只認(rèn)為在老師轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞中加入底物上機(jī)檢測就完成實(shí)驗(yàn)了，但是對細(xì)胞中報告基因如何進(jìn)入細(xì)胞，如何發(fā)揮作用都不了解。通過改進(jìn)，學(xué)生能夠通過計(jì)數(shù)來調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度然后傳代細(xì)胞，能根據(jù)細(xì)胞的濃度來調(diào)整質(zhì)粒的用量，并通過熒光顯微鏡判斷分析轉(zhuǎn)染的效率，如何使用激活劑并了解報告基因的處理和數(shù)據(jù)分析方法。對整個實(shí)驗(yàn)過程有了系統(tǒng)性的了解與認(rèn)識。

2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性

充分利用儀器設(shè)備資源，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，提高數(shù)據(jù)精確性［11］。依托本院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心以及大型儀器公共實(shí)驗(yàn)平臺的設(shè)備資源，通過實(shí)驗(yàn)室對本科生開放的機(jī)制，讓學(xué)生可以自主選擇對實(shí)驗(yàn)前后的拓展實(shí)驗(yàn)。通過使用更新升級的儀器設(shè)備（見圖1），嘗試不同試驗(yàn)數(shù)據(jù)的檢測方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，全面滲入實(shí)驗(yàn)課程每個細(xì)節(jié)。

2.1 檢測蛋白濃度方法改進(jìn)

原實(shí)驗(yàn)用721 分光光度計(jì)通過紫外吸收（OD280 nm波長）法來測定蛋白濃度，現(xiàn)在改用更精確靈敏的BCA法，同時配置了高效快速的多功能酶標(biāo)儀來測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更精準(zhǔn)。

2.2 增加通過轉(zhuǎn)染帶熒光標(biāo)簽的質(zhì)粒判斷轉(zhuǎn)染效率

通過倒置熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況，并通過拍照及軟件分析判斷熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率，增加收集一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，更精確地判斷報告基因的轉(zhuǎn)染效率。

2.3 改變細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

原有計(jì)數(shù)方法是通過血球計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)，耗時較長，通過購置全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，能快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)，縮短了實(shí)驗(yàn)時間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。

圖1 實(shí)驗(yàn)中使用的部分儀器圖

3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，拓展實(shí)驗(yàn)深度和廣度

3.1 調(diào)整實(shí)驗(yàn)中試劑加入量

在每個實(shí)驗(yàn)中，試劑加入量的準(zhǔn)確使用是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，所以，調(diào)整實(shí)驗(yàn)中的試劑加入量，作為預(yù)實(shí)驗(yàn)要確定的一個重要指標(biāo)。例如，報告基因檢測實(shí)驗(yàn)中需要用激活劑對細(xì)胞進(jìn)行處理，升高細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平，不同處理時間會有不同的結(jié)果，通過學(xué)生自行設(shè)計(jì)選擇不同的試劑濃度、處理時間，得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果找出最合適的激活劑計(jì)量，使實(shí)驗(yàn)在計(jì)量上更精確。最后通過學(xué)生對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理，得出最佳的處理時間。這樣每組學(xué)生的實(shí)驗(yàn)報告數(shù)據(jù)都是不同的，提高了學(xué)生對實(shí)驗(yàn)探索的興趣。

3.2 擴(kuò)充細(xì)胞種類

實(shí)驗(yàn)中研究對象的選擇為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供了很好的依據(jù)，因?yàn)榧偃缭谝环N細(xì)胞中沒有實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可能在另一種細(xì)胞中獲得滿意的結(jié)果，從而提高了學(xué)生分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。以本實(shí)驗(yàn)為例，從細(xì)胞傳代培養(yǎng)開始實(shí)驗(yàn)教師提供幾種不同的腫瘤細(xì)胞供學(xué)生選擇，除了在實(shí)驗(yàn)講義上使用的293T（人胚腎細(xì)胞），增加了CNE（人鼻咽癌細(xì)胞）、4T1（小鼠乳腺癌細(xì)胞）、A549（人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞）、Hela（人宮頸癌細(xì)胞）等多種腫瘤細(xì)胞供學(xué)生選擇使用。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同（見圖2），實(shí)驗(yàn)結(jié)果也不同，這種帶有探索性的實(shí)驗(yàn)過程，雖然以實(shí)驗(yàn)講義中的實(shí)驗(yàn)步驟為主干，卻大大提高了實(shí)驗(yàn)的自由度，也激發(fā)了學(xué)生科學(xué)探索的欲望，有利于學(xué)生掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，加深理解實(shí)驗(yàn)涉及的分子生物學(xué)原理。

4 結(jié) 語

在教學(xué)過程中實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，一般要求每個學(xué)生對結(jié)果進(jìn)行處理分析并詳細(xì)討論。數(shù)據(jù)越豐富，學(xué)生討論得越深入。在本實(shí)驗(yàn)中，由于每組同學(xué)使用的細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑及藥物處理時間的不同，每組學(xué)生得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不盡相同，學(xué)生不僅可以就本組的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，亦可橫向聯(lián)合多組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較、總結(jié)。增加了數(shù)據(jù)總結(jié)環(huán)節(jié)的挑戰(zhàn)性。通過這一過程，促進(jìn)學(xué)生對相關(guān)知識點(diǎn)的綜合學(xué)習(xí)和應(yīng)用，加深對已掌握的理論知識的理解，全面提高學(xué)生的自覺動手能力，拓寬視野，豐富思維，將知識融會貫通，從而得到較全面的科學(xué)分析與技能訓(xùn)練，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)實(shí)驗(yàn)素質(zhì)和綜合實(shí)驗(yàn)的能力［12-13］。

圖2 不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果熒光顯微鏡圖片

我院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程至今已開設(shè)16 年，逐漸形成了較穩(wěn)定的主講教師、實(shí)驗(yàn)輔助老師以及助教教學(xué)隊(duì)伍。實(shí)驗(yàn)條件近年來也得到極大提高，教學(xué)方法密切結(jié)合學(xué)科特點(diǎn)，受到學(xué)生和督導(dǎo)老師的一致好評。

報告基因檢測技術(shù)，是一種間接的測定技術(shù)，涉及報告基因載體質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、報告基因產(chǎn)物測定等環(huán)節(jié)。螢光素酶檢測系統(tǒng)是一個先進(jìn)指示系統(tǒng)［14］，操作簡便，靈敏度高，輝光型信號亮且持久，可用于因靈敏度不夠而受限的挑戰(zhàn)性應(yīng)用。通過本精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目將報告基因檢測技術(shù)介紹給學(xué)生，有一定的獨(dú)創(chuàng)性。通過實(shí)驗(yàn)全面提升學(xué)生對于分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識的理解，訓(xùn)練學(xué)生綜合實(shí)驗(yàn)的能力［15］。

同時由本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提出實(shí)驗(yàn)相關(guān)的問題啟發(fā)學(xué)生思考討論，更進(jìn)一步依托本院教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)室空間和設(shè)備資源開辟延伸課堂，通過實(shí)驗(yàn)室開放機(jī)制，鼓勵學(xué)生自主選擇對實(shí)驗(yàn)前后的拓展實(shí)驗(yàn)、試劑準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)操作、儀器設(shè)備使用、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化等方面介入實(shí)驗(yàn)過程每個細(xì)節(jié)，建立該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的延伸課堂體系。并在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中引導(dǎo)學(xué)生積極思考、訓(xùn)練其思維能力、動手能力和分析能力。通過實(shí)驗(yàn)報告評估，動手能力評價，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好壞，以及問題分析和解決方案的擬定等多個方面對學(xué)生進(jìn)行綜合考核。使學(xué)生逐步形成以自主式、合作式、研究式相結(jié)合的學(xué)習(xí)方式，激發(fā)學(xué)生興趣，鍛煉科研思維，培養(yǎng)運(yùn)用科研思維和系統(tǒng)組合各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)科研目標(biāo)的能力。