劉 杰，劉 剛，李姝潔，鄧子昂，歐全宏，時(shí)有明

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，昆明 650500；2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011)

水稻是人類(lèi)最重要的糧食作物。水稻種子在貯存過(guò)程中伴隨著老化的發(fā)生，理化性質(zhì)也會(huì)發(fā)生很大的變化[1]。種子老化會(huì)引起種子體內(nèi)貯藏物質(zhì)下降，有毒物質(zhì)累積，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，生理代謝紊亂[2]，從而導(dǎo)致發(fā)芽延遲，發(fā)芽率降低和種子活力顯著喪失，嚴(yán)重影響種子生產(chǎn)和食品安全[3]。因此，檢測(cè)水稻種子的老化程度，對(duì)水稻種子的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及食品安全具有重要意義。

傳統(tǒng)種子老化檢測(cè)方法是依據(jù)氣味、色澤等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判，具有一定的主觀(guān)性；常規(guī)方法包括標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)、電導(dǎo)率試驗(yàn)、幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)、低溫發(fā)芽試驗(yàn)和四唑染色測(cè)定等，不僅耗時(shí)且具有破壞性，并需要一定的訓(xùn)練經(jīng)驗(yàn)[5]。新型檢測(cè)技術(shù)中，Yan等[5]基于氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法探索自然儲(chǔ)存條件下兩種雜交水稻種子之間的代謝組差異，對(duì)種子貯存性進(jìn)一步了解。高艷琪等[6]基于近紅外光譜和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立檢測(cè)模型，可對(duì)老化水稻種子達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)。吳小芬等[7]基于兩種老化的水稻種子，利用高光譜成像和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法檢測(cè)種子的活力。Fang等[8]利用紅外熱成像技術(shù)和廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)建立模型，檢測(cè)老化水稻種子的發(fā)芽率。李歡歡等[9]采用光聲光譜技術(shù)結(jié)合LS-SVR建立模型對(duì)稻種活力進(jìn)行較好預(yù)測(cè)精度的測(cè)定。Hassan等[10]利用基于氣態(tài)傳感的電子鼻技術(shù)追蹤香稻米和非香稻米存儲(chǔ)過(guò)程中香氣的變化，對(duì)水稻種子的老化過(guò)程進(jìn)行評(píng)估。這些無(wú)損技術(shù)在應(yīng)用過(guò)程中都存在一定的缺點(diǎn)，如近紅外光譜技術(shù)(NIR)和高光譜成像(HIS)或多光譜成像(MSI)的缺點(diǎn)是每種樣品都需要一個(gè)新的校準(zhǔn)模型，校準(zhǔn)模型需要收集大量數(shù)據(jù)集，預(yù)測(cè)精度取決于多種外界因素；光聲光譜技術(shù)操作比較復(fù)雜，需要專(zhuān)門(mén)的訓(xùn)練經(jīng)驗(yàn)；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的預(yù)處理復(fù)雜且價(jià)格高昂；電子鼻技術(shù)需要重復(fù)建模，工作量較大；紅外熱成像(IRT)在種子質(zhì)量評(píng)估中應(yīng)用成本高，檢測(cè)效率低等[5]。

FT-IR是一種快速無(wú)損的技術(shù)，具有從宏觀(guān)上識(shí)別整個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)[11]。SD-IR用來(lái)提高光譜的分辨率[12]，利用二維相關(guān)紅外光譜(2 D-IR)通過(guò)溫度微擾對(duì)各組分基團(tuán)分子的振動(dòng)行為進(jìn)行分析[13]。紅外光譜技術(shù)已用于農(nóng)作物種子檢測(cè)[14]。Genkawa等[15]利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)光譜并基于二階導(dǎo)數(shù)建立回歸曲線(xiàn)，計(jì)算水稻儲(chǔ)存過(guò)程的游離脂肪酸的變化。Wu等[16]基于傅里葉變換紅外光聲光譜法(FTIR-PAS)記錄水稻葉片的光譜，有效診斷水稻氮素營(yíng)養(yǎng)狀況。Priyanka等[17]利用ATR-FTIR光譜法對(duì)水稻種子中的官能團(tuán)進(jìn)行檢測(cè)，基于激光燒蝕-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(LA-ICP-MS)定量測(cè)定水稻種子橫截面中Zn、As、Cd、Pb和Sb等元素在空間水平上的分布。楊衛(wèi)梅等[14]利用傅里葉變換紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜快速有效的對(duì)自然老化下的谷類(lèi)種子進(jìn)行區(qū)分。

本研究采用高溫高濕法對(duì)楚粳29號(hào)和楚粳40號(hào)水稻種子進(jìn)行人工加速老化處理，利用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜(SD-IR)結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜(2 D-IR) 研究人工老化水稻種子，以期建立一種有效、快速檢測(cè)水稻種子老化的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和參數(shù)

美國(guó)Perkins Elmer公司生產(chǎn)配備DTGS探測(cè)器的Frontier型傅里葉變換換紅外光譜儀，測(cè)定范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)16，分辨率為4 cm-1。Eurotherm公司生產(chǎn)的SYD-TC-01型溫度控制儀，在50～120 ℃范圍內(nèi)每隔10 ℃采集一次光譜。

1.2 樣品制備

供試水稻種子為2019年收獲的楚粳29號(hào)和楚粳40號(hào)，挑選顆粒飽滿(mǎn)、無(wú)霉變、大小形狀基本相同的種子。設(shè)置LS-150 S種子老化箱的溫度為45 ℃，濕度為95%，將每個(gè)品種種子隨機(jī)分成5組，放入老化箱內(nèi)。分別在老化2 d、4 d、6 d、8 d、10 d各取出一組水稻種子，得到未老化、老化2 d、4 d、6 d、8 d、10 d等6組試驗(yàn)水稻種子樣品。老化處理后的水稻種子放置于室溫下晾曬，曬干后放入密封袋冷藏備用。

1.3 紅外光譜采集

將人工老化水稻樣品和溴化鉀分別研磨成細(xì)粉，以一定的比例混合，研磨均勻后進(jìn)行壓片測(cè)量，扣除溴化鉀背景。

光譜采集使用Spectum 10軟件，對(duì)原始IR光譜進(jìn)行13點(diǎn)平滑后獲得SD-IR光譜。使用由清華大學(xué)化學(xué)系編程的2 D-IR相關(guān)分析軟件，對(duì)在50～120 ℃每隔10 ℃采集得到的動(dòng)態(tài)光譜進(jìn)行處理，獲得2 D-IR光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

圖1和圖2為人工老化楚粳29號(hào)和楚粳40號(hào)水稻種子的傅里葉變換紅外光譜。從圖中可知，人工老化楚粳29號(hào)水稻種子的傅里葉變換紅外光譜整體相似；人工老化楚粳40號(hào)水稻種子的傅里葉變換紅外光譜整體相似；兩種水稻種子在老化過(guò)程中的傅里葉變換紅外光譜整體相似。表1是人工老化楚粳29號(hào)和楚粳40號(hào)水稻種子在傅里葉變換紅外光譜中出現(xiàn)的特征峰，由表可知水稻種子在人工老化過(guò)程中吸收峰沒(méi)有明顯差異。因此，對(duì)人工老化水稻種子的研究，需進(jìn)一步的分析。

表1 水稻種子的傅里葉變換紅外光譜吸收峰Table 1 Absorption peaks of rice seeds by Fourier transform infrared spectroscopy

2.2 二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析

老化水稻種子原始紅外光譜差異不大，而導(dǎo)數(shù)光譜具有更高的分辨率，能夠顯示更多的分子信息。選用Savitsky-Golay方法，對(duì)老化水稻種子樣品的紅外光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理。

圖3是人工老化楚粳29號(hào)水稻種子在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜。水稻種子在1 745 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨老化程度增加呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，在老化4 d和老化6 d時(shí)出現(xiàn)一定下降，在老化10 d時(shí)增至最強(qiáng)。在1 658 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，在老化6 d增至最強(qiáng)，老化10 d的強(qiáng)度最弱。在1 548 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈減弱趨勢(shì)，在老化2 d時(shí)出現(xiàn)一定增強(qiáng)。在1 209 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈減弱的趨勢(shì)，在老化4 d時(shí)出現(xiàn)一定增強(qiáng)，老化4～10 d呈連續(xù)下降趨勢(shì)。人工老化水稻種子在1 466、1 379 cm-1附近的吸收峰隨著老化程度的增加呈增強(qiáng)趨勢(shì)。在1 417、1 338、1 109、922、861 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著老化程度的增加呈先增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)。

圖4為人工老化楚粳40號(hào)水稻種子在1 800～800 cm-1范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜。人工老化楚粳40號(hào)水稻種子在1 657 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度呈先增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)，在老化4 d時(shí)增至最強(qiáng)，老化10 d時(shí)強(qiáng)度最弱。在1 305 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著老化程度增加呈增強(qiáng)趨勢(shì)，在老化8 d時(shí)出現(xiàn)一定下降趨勢(shì)，老化10 d時(shí)吸收峰強(qiáng)度最強(qiáng)。1 339、1 020、986、861 cm-1附近吸收峰強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢(shì)。1 209、1 122、1 109、922 cm-1范圍內(nèi)吸收峰強(qiáng)度隨老化程度的增加呈先減弱再增強(qiáng)的趨勢(shì)。1 379、1 082 cm-1附近吸收峰強(qiáng)度隨老化程度的增加呈先增強(qiáng)再減弱的趨勢(shì)。

綜上所述，老化水稻種子在1 745 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度隨著老化程度的增加而增強(qiáng)，表明水稻種子中的脂類(lèi)物質(zhì)在隨著老化程度的增加而增加；在1 548 cm-1附近吸收峰強(qiáng)度發(fā)生明顯的減弱，表明水稻種子中蛋白質(zhì)隨著老化過(guò)程的增加而減少；在1 209 cm-1附近的吸收峰強(qiáng)度在減小，表明水稻種子中的糖類(lèi)物質(zhì)在隨著老化程度的增加而減少。

2.3 二維相關(guān)紅外光譜分析

二維相關(guān)紅外光譜(2 D-IR)受溫度擾動(dòng)產(chǎn)生光譜強(qiáng)度的變化，獲得更多的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)信息[12]。對(duì)楚粳29號(hào)和楚粳40號(hào)人工老化水稻種子進(jìn)行二維相關(guān)紅外處理，為水稻種子老化檢測(cè)提供依據(jù)。

圖5是人工老化楚粳29號(hào)水稻種子在800～1 350 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。未老化和老化水稻種子在800～1 350 cm-1范圍內(nèi)均出現(xiàn)6個(gè)強(qiáng)自動(dòng)峰，分別出現(xiàn)在837、879、945、1 066、1 139、1 224 cm-1附近。未老化、老化2 d、老化4 d、老化8 d的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在879 cm-1附近，老化6 d的在1 221 cm-1附近表現(xiàn)為最強(qiáng)峰，老化10 d的水稻種子的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在879 cm-1和1 224 cm-1附近。未老化水稻種子在945 cm-1和1 139 cm-1處自動(dòng)峰表現(xiàn)相同的強(qiáng)度；老化后水稻種子，水稻種子在1 139 cm-1附近的自動(dòng)峰強(qiáng)度高于945 cm-1處。水稻種子在834、1 066、1 139 cm-1附近的自動(dòng)峰，在老化6 d時(shí)處表現(xiàn)為最強(qiáng)，在老化4 d時(shí)表現(xiàn)為最弱。

圖6為人工老化楚粳40號(hào)水稻種子在800～1 350 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜。未老化和老化楚粳40號(hào)水稻種子均出現(xiàn)了6個(gè)強(qiáng)自峰，分別出現(xiàn)在836、879、945、1 066、1 139、1 224 cm-1附近。未老化、老化2 d、老化10 d水稻種子的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在879 cm-1處，老化4 d的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在885 cm-1，老化6 d的最強(qiáng)峰出現(xiàn)在885 cm-1和1 223 cm-1附近，老化8 d最強(qiáng)峰出現(xiàn)在1 223 cm-1處。未老化水稻種子在945、1 066 cm-1處自動(dòng)峰表現(xiàn)相同的強(qiáng)度；老化4 d和老化10 d水稻種子在945 cm-1附近的自動(dòng)峰強(qiáng)度高于1 066 cm-1處；老化2 d，老化6 d及老化8 d水稻種子在945 cm-1附近自動(dòng)峰強(qiáng)度弱于1 066 cm-1處。1 066 cm-1和1 137 cm-1處的自動(dòng)峰在未老化水稻種子處表現(xiàn)最弱，在老化8 d處表現(xiàn)最強(qiáng)。

3 結(jié) 論

利用傅里葉變換紅外光譜、二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二維相關(guān)紅外光譜研究人工老化的兩種水稻種子。結(jié)果表明，在原始光譜中，人工老化水稻種子的光譜整體相似；兩種水稻種子老化過(guò)程的原始光譜整體相似。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析顯示，老化水稻種子吸收峰的位置和強(qiáng)度表現(xiàn)出差異；兩種老化水稻種子光譜顯示出差異，在楚粳29號(hào)水稻種子中，老化水稻種子吸收峰差異表現(xiàn)較為明顯，在楚粳40號(hào)水稻種子中吸收峰差異表現(xiàn)較為復(fù)雜。在800～1 350 cm-1范圍內(nèi)對(duì)老化水稻種子進(jìn)行二維相關(guān)分析，未老化和老化水稻種子的差異較為明顯，老化后水稻種子的自動(dòng)峰強(qiáng)度表現(xiàn)出差異，最強(qiáng)峰的位置和強(qiáng)度發(fā)生改變；兩種水稻中在自動(dòng)峰強(qiáng)度變化表現(xiàn)出差異，楚粳29號(hào)水稻種子在老化10 d處變化較為明顯，楚粳40號(hào)水稻種子在老化6 d處變化較為明顯。結(jié)果表明，紅外光譜法可以快速、有效地區(qū)分不同老化程度的水稻種子，可以對(duì)不同品種的老化水稻種子進(jìn)行一定的區(qū)分。但是，對(duì)不同品種水稻種子差異變化，還有待更進(jìn)一步的研究。