周 展， 李 燚

(山東省立第三醫(yī)院婦科， 山東 濟(jì)南 250031)

宮頸癌(Cervical cancer,CC)是全球第三大女性特異性癌癥，每年約有530000新診斷病例[1]。研究數(shù)據(jù)表明，CC發(fā)病率主要發(fā)生在發(fā)展中國家，如東部和西部非洲、南美和中南亞，并伴有嚴(yán)重的死亡率[2]。盡管放射治療和根治性子宮切除術(shù)在治療早期浸潤性宮頸癌、局部復(fù)發(fā)風(fēng)險的方面取得了出色的進(jìn)展，但預(yù)后仍不能令人滿意[3]。因此，迫切需要找到新的鑒定CC標(biāo)志物并探索CC治療的新治療策略。激活轉(zhuǎn)錄因子2(Activating transcription factor 2,ATF2)屬于堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族。ATF2在腫瘤中起抑制或促進(jìn)作用，并參與細(xì)胞應(yīng)激、DNA損傷等過程。ATF2的激活主要是通過應(yīng)激刺激后的磷酸化修飾來實現(xiàn)的。磷酸化的ATF2與靶基因的啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，例如細(xì)胞周期分子、黏附分子和凋亡相關(guān)分子，從而激活靶基因的表達(dá)。Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)ATF2在腎細(xì)胞癌中可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白D1、波形蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，Song等[5]研究已證實miR-204可以特異性抑制ATF2蛋白的表達(dá)并調(diào)節(jié)人腦角化細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。但是ATF2在宮頸癌中的研究甚少。因此，在本實驗中，我們首先檢測ATF2在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，此外，本實驗利用shRNA轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞以構(gòu)建ATF2低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株，觀察沉默ATF2抑制自噬對宮頸癌細(xì)胞化療敏感性的影響，為ATF2在宮頸癌進(jìn)展中的重要性及其作為新的治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要材料

1.1.1臨床樣本:收集2017年12月至2019年12月在我院接受宮頸癌切除手術(shù)患者作為實驗組，患者共40例，年齡33～67歲，平均年齡(52.37±4.16)歲；所有患者經(jīng)病理確診為宮頸癌且均在手術(shù)前未進(jìn)行放、化療。選取同期宮頸良性病變患者者30例作為對照組，年齡35～65歲，平均年齡(49.85±4.03)歲。兩組年齡沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。所有患者經(jīng)病理確診為宮頸癌且均在手術(shù)前未進(jìn)行放、化療，且術(shù)前均簽署了知情同意書。所有組織標(biāo)本都保存在-80℃直至使用。

1.1.2細(xì)胞:正常宮頸上皮細(xì)胞HcerEpic和宮頸癌細(xì)胞系(HeLa、SiHa、C33A、MS751)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.3主要試劑:MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。順鉑(cisplatin,DDP)購自上海源葉生物科技有限公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。TRIzol試劑、PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒和TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司。shNC、shATF2和GFP-LC3質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。LipofectamineTM 3000購自美國Invitrogen公司。Annexin V/PI試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Abcam公司。ATF2抗體、LC3A/B抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體和IgG-HRP抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):HcerEpic細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基；HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞、C33A細(xì)胞和MS751細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分。取對數(shù)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與DDP處理:HeLa細(xì)胞按照1×105個/孔接種在24孔板中，細(xì)胞隨機(jī)分為三組，control+DDP(10μg/mL)組、shNC+DDP(10μg/mL)組和shATF2+DDP(10μg/mL)組。待細(xì)胞生長融合至60%時，按照LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行順時轉(zhuǎn)染，其中shNC和shATF2的轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmoL/L(經(jīng)驗證順時轉(zhuǎn)染成功)；48 h后，每組細(xì)胞中加入DDP；再48 h后結(jié)束培養(yǎng)，收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3細(xì)胞克隆形成:培養(yǎng)結(jié)束后的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化以1×103個/孔接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。14d后，用結(jié)晶紫溶液染色細(xì)胞，并計數(shù)含有≥50個細(xì)胞的集落，顯微鏡拍攝代表性集落并統(tǒng)計。

1.2.4細(xì)胞免疫熒光染色:培養(yǎng)結(jié)束后的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后按照1×105個/孔接種在24孔板中，用GFP-LC3質(zhì)粒(1μg/mL)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。培養(yǎng)48h后，使用倒置顯微鏡捕獲GFP-LC3點的積累。通過使用ImageJ軟件對GFP-LC3點的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。

1.2.5細(xì)胞流式術(shù):培養(yǎng)結(jié)束后的各組細(xì)胞，離心并重懸于緩沖液中。細(xì)胞依次用異硫氰酸熒光素(FITC)溶液(10μL)和碘化丙啶(PI)溶液(10μL)染色，之后將細(xì)胞在室溫下黑暗環(huán)境中孵育30min，然后使用FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色法:宮頸癌組織和正常組織經(jīng)固定，包埋，石蠟切片、脫水、緩沖液清洗，3%過氧化氫溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加非免疫動物血清20min，滴加一抗、PBS沖洗、滴加二抗、沖洗后加ABC復(fù)合物、DAB顯色，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，用MIAS圖像分析系統(tǒng)分析，按照免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計。目標(biāo)蛋白呈棕黃色，則為陽性表達(dá)。

1.2.7qRT-PCR:TRIzol試劑提取組織樣本或者細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度計檢測樣品RNA濃度。使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。ATF2：正向5'-TGGTAGCGGATTGGTTAGG-3'，反向5'-TTGGGTCTGTGGAGTTGTG-3'；GAPDH：正向5'-TGGATCAGCAAGCAGCAGGAGTA-3'，反向5'-TCGGCCACATTGTGTGAACTTT-3'。使用TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。使用StepOnePlus儀器完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.2.8Western blot:RIPA裂解液提取組織樣本或者細(xì)胞中的總蛋白，并通過BCA法測定總蛋白含量，并將配對的樣品調(diào)節(jié)至相同濃度。樣品經(jīng)變性后，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1h，之后將PVDF膜分別與以下抗體在4℃孵育過夜：ATF2抗體(1∶1000)、LC3A/B抗體(1∶1000)、Bax抗體(1∶1000)、Bcl-2抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與IgG-HRP抗體(1∶5000)孵育1h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5min。最后顯影曝光，Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1ATF2在宮頸癌組織中的表達(dá):免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明(圖1A)：ATF2在宮頸癌組織中的表達(dá)(75.23%)較正常組織(8.08%)明顯增加(P<0.01)；qRT-PCR結(jié)果表明(圖1B)：與正常組織組比較，ATF2 mRNA在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。

圖1 ATF2在宮頸癌組織中的表達(dá)

2.2ATF2在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá):qRT-PCR結(jié)果表明(圖2A)：ATF2 mRNA在宮頸癌細(xì)胞系(MS751、SiHa、HeLa、C33A)中的表達(dá)較HcerEpic細(xì)胞明顯增加(P<0.01)；Western blot結(jié)果表明(圖2B)：與HcerEpic組比較，ATF2蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；其中HeLa細(xì)胞中ATF2的表達(dá)水平最高，因此，后續(xù)實驗選擇HeLa細(xì)胞。

圖2 ATF2在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞增殖的影響:qRT-PCR結(jié)果表明(圖3A)：與control組和shNC比較，shATF2組HeLa細(xì)胞中ATF2 mRNA的表達(dá)水平明顯下調(diào)(均P<0.01)；Western blot結(jié)果表明(圖3B)：與control組和shNC比較，shATF2組HeLa細(xì)胞中ATF2蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)(均P<0.001)；細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果表明(圖3C)：與control組和shNC比較，shATF2組HeLa細(xì)胞的集落數(shù)目明顯減少(均P<0.01)。

2.4沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的影響:Western blot結(jié)果表明(圖4A)：加入10μg/mL DDP后，與control組和shNC組比較，shATF2組HeLa細(xì)胞中LC3 Ⅱ/LC3 I蛋白表達(dá)水平比例明顯下降(P<0.01)；細(xì)胞免疫熒光染色法表明(圖4B)：加入10μg/mL DDP后，與control組和shNC組比較，shATF2組HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)目減少(P<0.01)。

圖3 沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞增殖的影響

圖4 沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬的影響

圖5 沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡作用的影響

2.5沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡作用的影響:細(xì)胞流式術(shù)結(jié)果表明(圖5A)：加入10μg/mL DDP后，與control組和shNC組比較，shATF2組HeLa細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P<0.01)；Western blot結(jié)果表明(圖5B)：加入10μg/mL DDP后，與control組和shNC組比較，shATF2組HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.001)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.001)。

3 討 論

目前，手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法是宮頸癌的主要治療方法。盡管經(jīng)治療后患者總生存率已有一定程度的提高，但術(shù)后復(fù)發(fā)、淋巴轉(zhuǎn)移和對周圍正常組織的毒副作用仍沒有好的治療方法。目前，在宮頸癌的臨床治療中靶向治療的研究已被醫(yī)務(wù)工作者廣泛關(guān)注。

ATF2位于2號染色體臂3區(qū)2帶，是激活蛋白1超家族的成員。JNK或P38激活后，ATF2與其他轉(zhuǎn)錄因子異源二聚體(靶蛋白泛素特異性蛋白酶14)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和分化。此外，ATF2可以通過應(yīng)激或細(xì)胞因子刺激來激活，以響應(yīng)DNA損傷、病毒感染和細(xì)胞死亡。ATF2與炎癥和神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，也與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[6]。根據(jù)腫瘤類型及其亞細(xì)胞定位，已證明ATF2可作為致癌基因或抑癌基因。研究發(fā)現(xiàn)，ATF2在非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，并且與不良預(yù)后與關(guān)[7,8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ATF2在胰腺癌中高表達(dá)，然而沉默ATF2增強(qiáng)了吉西他濱誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用。但是ATF2在宮頸癌中研究甚少，我們的臨床數(shù)據(jù)表明，宮頸癌組織中ATF2的表達(dá)高于非腫瘤組織，這促使我們提出了ATF2可能在宮頸癌中起致癌作用的假說。此外ATF2還可作為診斷宮頸癌的潛在生物標(biāo)記。

自噬是一個吞噬自身細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究表明，自噬在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[10]。Fukuda[11]等研究表明，氯喹通過自噬抑制作用從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖并克服順鉑耐藥性。Hong等[12]研究表明，辣椒素通過抑制化學(xué)療法誘導(dǎo)的自噬提高膽管癌的藥物敏感性。本文研究發(fā)現(xiàn)，沉默ATF2能明顯抑制HeLa細(xì)胞中LC3 Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達(dá)比例的上調(diào)，減少HeLa細(xì)胞中自噬體數(shù)量，表明沉默ATF2對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞自噬有抑制作用。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。我們的結(jié)果表明，沉默ATF2可誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。研究表明，Bcl-2的啟動子區(qū)域包含可以響應(yīng)ATF-2的環(huán)狀A(yù)MP響應(yīng)元件[13]。我們的研究表明，沉默ATF2使HeLa細(xì)胞中Bax水平升高而Bcl-2水平降低，這為響應(yīng)ATF2沉默的凋亡事件提供了分子證據(jù)。Bax和Bcl-2的比例與線粒體通透性過渡孔的開放有關(guān)。這里Bax和Bcl-2水平的變化也暗示線粒體可能參與了沉默ATF2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但是還需要進(jìn)一步的研究來檢驗這一假設(shè)。

綜上所述，ATF2在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)。沉默ATF2可以抑制HeLa細(xì)胞的增殖與自噬，并增加細(xì)胞凋亡來提高HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性。因此，ATF2具有作為宮頸癌診斷生物標(biāo)志物的潛在價值，并且ATF2也可能成為宮頸癌治療的有希望的靶標(biāo)。