鄭亞君，路芳芳，張智平

(西安石油大學 化學化工學院，陜西 西安 710065)

質譜技術因具有靈敏度高、選擇性好、特異性強等特點，已廣泛應用于環(huán)境、生物、食品等各種復雜樣品的檢測分析。在諸多質譜分析方法中，色譜-質譜聯用技術是現今復雜樣品分析最權威、最可靠的方法，但這種技術在分析前需對樣品進行繁瑣的預處理，無法實現復雜樣品的快速分析。為了解決這一問題，2004年美國普度大學Cooks教授[1]提出了常壓離子化質譜(Ambient ionization mass spectrometry,AIMS)分析技術，該技術具有無需樣品預處理、操作簡單、分析時間短、可實現復雜樣品的實時、快速檢測等優(yōu)點，現今已發(fā)展出不同類型的常壓電離源技術，如解吸電噴霧電離源(Desorption electrospray ionization,DESI)[2]、實時直接分析(Direct analysis in real time,DART)[3]、紙噴霧電離源(Paper spray ionization,PSI)[4]等。雖然AIMS分析技術已廣泛應用于不同領域，但其在復雜樣品的電離過程中，基質中的干擾化合物(如金屬鹽)與待測目標化合物將同時被電離，在一定程度上嚴重抑制了待測化合物的高靈敏分析。為了提高對復雜樣品的分析性能，有必要在AIMS分析前進行目標化合物富集或者樣品基質的去除。

固相微萃取(Solid phase microextraction,SPME)是1990年加拿大滑鐵盧大學Arthur和Pawliszyn[5]提出的一種樣品制備技術，它將樣品的采集、萃取、濃縮和分析整合為一步，極大地簡化了樣品的制備過程和分析流程，為復雜基質中目標化合物的高靈敏度分析提供了有效途徑。固相微萃取是將少量固體吸附材料涂覆或鍵合在不同基體表面(如纖維、攪拌子、毛細管內壁、金屬絲外壁等)，由于該技術無需溶劑、易于微型化、便于攜帶和自動化，已廣泛應用于食品、環(huán)境、藥品和生物樣品等諸多領域[6-9]。將AIMS與SPME耦合，可實現復雜樣品的快速、高靈敏度分析，現今已發(fā)展起來多種SPME-AIMS分析方式。本文系統(tǒng)總結了近年來新發(fā)展的可直接與常壓電離源相聯用或可原位電離目標化合物的固相微萃取技術，主要包括探針式、管內富集式、葉片式、網格式、表面涂層式、濾膜/濾紙分離式等，并詳細論述了其工作原理及質譜分析性能，展望了該技術的發(fā)展趨勢。

1 探針式固相微萃取

探針式固相微萃取(Probe-based SPME)是現今使用最為廣泛的一種樣品富集技術，其采樣及樣品解吸電離過程如圖1所示。該技術首先是將吸附劑材料或化合物官能團負載在金屬絲、金屬針或纖維的尖端，然后在樣品采集前采用合適溶劑對探針尖端的吸附材料進行活化和表面吸附雜質的去除，接著用其吸附復雜樣品中的目標化合物，待吸附完成后再采用適當溶劑將探針吸附層表面的樣品基質或干擾物洗滌，最后將探針吸附層放入含有噴霧溶劑的毛細管中進行原位解吸、電離以及質譜分析。采用該技術，人們已對不同復雜樣品進行了快速、高靈敏度分析。如Deng等[10]通過二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨修飾的金屬探針對目標化合物進行富集，并將其與納升電噴霧電離源(Nanoelectrospray ionization,nanoESI)相聯用分析了大型蚤卵細胞中的全氟辛基磺酸和全氟辛酸化合物，檢出限可達20～30 pg·mL-1。Hou等[11]采用共價有機框架材料涂覆的金屬探針富集環(huán)境水樣和血樣中的氟烷基化合物，然后與納升電噴霧質譜分析相結合，可在1～5 000 ng·L-1質量濃度范圍內分析水樣中14種氟烷基化合物，線性相關性良好，檢出限為0.02～0.8 ng·L-1。Gómez-Ríos等[12]采用生物兼容性的C18-SCX修飾金屬探針分析了不同生物樣品(如磷酸鹽緩沖溶液、尿樣、血樣)中的多種藥物化合物，每個樣品的分析時間小于2 min，分析靈敏度可達30～100 pg·mL-1。Zhao等[13]采用納米TiO2修飾的金屬探針富集胰蛋白酶解β-酪蛋白和牛血清蛋白中磷酸肽，然后將探針直接放入納升電噴霧毛細管中對目標化合物進行解吸和質譜分析，發(fā)現該方法對復雜生物基質中磷酸肽具有獨特的富集選擇性和分析靈敏度。Gong等[14]采用尖端直徑為1 μm、表面氧化的鎢絲作為探針，直接對洋蔥單細胞中的代謝物(如果聚糖、脂類、黃酮衍生物等)進行富集，然后將溶劑加載在鎢絲尖端對代謝物進行洗脫和質譜分析。相比于傳統(tǒng)方法先將富集化合物從探針尖端洗脫下來再進行質譜分析，該方法的靈敏度提升了30倍。金屬探針因其獨特的機械強度和尺寸可調變性，再經表面修飾后不僅適用于常量樣品中目標化合物的富集，同時也在微量/痕量樣品(如單細胞)分析方面發(fā)揮了重要作用。隨著該技術的進一步發(fā)展，探針式固相微萃取將會在復雜生物體系代謝組學、生理功能等研究方面起到關鍵作用。

圖1 探針式固相微萃取用于采樣和質譜分析過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of probe-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

除金屬材質可作為探針外，纖維、牙簽等也可作為探針用于復雜樣品基質中目標化合物的富集。Yang等[15]利用C18修飾纖維選擇性富集尿樣中5種羥基化多環(huán)芳烴，并在納升毛細管中解吸、電離和質譜分析，方法的線性范圍為0.1～5.0 ng·L-1，檢出限低于0.05 ng·L-1，回收率可達85.3%～95.3%。Wang等[16]將SPME與熱解吸電噴霧電離(Thermal desorption electrospray ionization,TDESI)相結合，考察了聚丙烯酸酯涂覆纖維對水中雙酚A的富集效果，檢出限低于1 ng·mL-1；同時發(fā)現在萃取過程中，纖維探針的數量越多，目標化合物的富集效率越高。Wu等[17]將C18鍵合SPME纖維與醫(yī)用棉簽相結合，富集口腔、鼻腔及皮膚表面的環(huán)境污染物和藥物，隨后將其插入納升毛細管進行解吸和質譜分析，檢出限可達1.0 pg·mL-1。Mirabelli和Zenobi[18]以PDMS纖維為固相微萃取相，與大氣壓光電離(Atmospheric pressure photo ionization,APPI)相結合，用于分析極性或非極性的農殘、藥物和多環(huán)芳烴化合物，靈敏度可達pg·mL-1，分析時間小于2 min。Hu等[19]采用C18、NH2、SO3H等官能團修飾的牙簽作為探針，富集和分析芥子酸膽堿、甘氨酸-甘氨酸-組氨酸-丙氨酸(Gly-Gly-His-Ala)、丙氨酸、天冬氨酸等目標化合物。但纖維、牙簽等材質由于自身的強度或尺寸限制，目前在痕量樣品的分析方面應用較少。

2 管內富集式固相微萃取

管內富集式固相微萃取(In-tube enrichment based SPME)早期主要用于色譜分析前復雜樣品中目標化合物的分離富集[20-21]。該技術是采用鍵合固定相、吸附劑、纖維、整體柱材料等對石英毛細管內壁進行修飾或填充，然后利用毛細管內固定相或吸附劑富集樣品中待測化合物。目前管內富集式SPME除了與色譜等技術聯用外，許多研究也將其與常壓電離源(如nanoESI、DART等)相結合，用于目標化合物的快速質譜分析(圖2)。Chang等[22]將氣相色譜毛細管與注射器相結合，利用毛細管內壁涂層材料的吸附性能富集母乳中有機碘化物，再經溶劑洗脫到納升毛細管中進行質譜分析，整個分析過程僅需8 min，消耗樣品體積為50 μL。Wang等[23]將聚合物甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯-單壁碳納米管(MAA-EDMA-SWNT)整體柱與注射器相結合，利用整體柱中固相材料富集水樣中6種三嗪類除草劑，隨后采用DART電離源對整體柱富集的化合物進行電離質譜分析，檢出限可達0.06～0.46 ng·mL-1，回收率為85.0%～106%，相對標準偏差(RSD)為3.1%～11%。雖然管內富集式SPME可利用柱管內吸附劑或修飾固定相對目標化合物進行富集，但其最大缺陷是不能對復雜樣品(如血樣等)直接進行萃取，否則會導致柱管堵塞；另一個缺陷是富集化合物柱管內的洗脫速度受控于注射器，實現自動化操作較為繁瑣。

圖2 管內富集式固相微萃取用于采樣和質譜分析過程示意圖Fig.2 Schematic diagram of in-tube enrichment based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

3 葉片式固相微萃取

葉片式固相微萃取(Blade-based SPME)是2014年Gómez-Ríos和Pawliszyn等[24-25]提出的一種樣品富集模式，該技術首先將有機聚合物(如C18-聚丙烯腈)涂覆在含有三角形尖端的不銹鋼薄片上，樣品分析前先采用適當溶劑(如甲醇-水)對含有聚合物涂層的不銹鋼薄片預處理，接著在渦流振蕩的條件下，將其放入樣品溶液中對目標化合物進行富集，隨后用水溶液洗去不銹鋼薄片表面吸附的干擾物，最后加載噴霧溶劑進行電離質譜分析(如圖3)。相比探針式固相萃取，葉片式固相微萃取由于吸附劑與樣品接觸面積更大，所以富集效率更高，同時可進行原位樣品解吸、電離。為了實現高通量分析，該研究小組將葉片式固相微萃取制成96孔平板，可同時對96個樣品進行富集處理，每個樣品的分析時間小于55 s，準確度大于90%,精密度為2.5%左右，濃度動力學范圍線性系數(r2)大于0.99，復雜生物樣品中目標化合物的檢出限為0.1～10 ng·mL-1[26]?，F今，該方法已應用于不同復雜樣品如血漿、血清、尿樣、生物組織等中化合物的快速質譜分析[27-30]。葉片式固相微萃取集樣品采集與原位解吸電離于一體，可快速實現目標化合物的富集與質譜分析，已實現了96個樣品的同時萃取富集，為實現批量樣品的自動化操作奠定了堅實的基礎。

圖3 葉片式固相微萃取用于采樣和質譜分析過程示意圖Fig.3 Schematic diagram of blade-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

4 網格式固相微萃取

網格式固相微萃取(Mesh-based SPME)源于Chipuk和Brodbelt[31]提出的傳輸模式解吸電噴霧電離源(Transmission mode desorption electrospray ionization,TMDESI)研究，最初為簡化解吸電噴霧電離源的結構，他們首先將液體樣品滴加在不同材質的網格上，然后采用電噴霧電離源對網格上的化合物進行解吸電離和質譜分析。研究發(fā)現隨著網格材質的變化，羅丹明6G的信號呈現出聚丙烯>聚醚醚酮(PEEK) >尼龍>滌綸>不銹鋼的變化趨勢，同時也發(fā)現該方法不適合未經處理樣品的分析。隨后，Jones和Fernández[32]將不銹鋼網格與DART電離源聯用，用于人血清代謝指紋譜圖的研究。為了提高不銹鋼網格對復雜樣品中目標化合物的分析性能，Gómez-Ríos和Pawliszyn[33]首先采用C18-聚丙烯腈材料對不銹鋼網格進行修飾，然后利用修飾后的網格作為固相微萃取固定相富集復雜樣品中的目標化合物，再進行DART電離源解吸和質譜分析(如圖4)，結果表明復雜基質(如磷酸鹽緩沖液)中目標化合物的檢出限可達pg·mL-1級。同時比較了網格式SPME與傳統(tǒng)SPME纖維(Fibre)、薄膜結構(Thin-film configuration)SPME和柱管結構(In-tube configuration)SPME的性能，發(fā)現傳統(tǒng)SPME纖維需在樣品分析前仔細調整纖維與進樣口間的距離，以防DART氣流吹掃引起纖維的振動，造成樣品解吸、電離分析結果的不重復[34]；對于薄膜結構SPME，由于表面涂層的致密性，無法使DART電離源氣流有效通過薄膜，進而影響樣品的解吸與電離；柱管結構SPME不僅操作繁瑣，需注射泵來控制解吸溶劑的流速，同時樣品富集前需對樣品離心、過濾，以防樣品基質材料、顆粒、纖維或蛋白等堵塞管道[23]；而采用網格式SPME可有效避免上述缺陷。由于PEEK材料具有良好的生物兼容性、不與各種溶劑反應、耐受高溫達350 ℃等優(yōu)點，Vasiljevic等[35]將其涂覆在金屬網格表層，然后對復雜生物基體(如唾液和尿樣)中的禁用藥物進行富集和質譜分析，檢出限可達0.5 ng·mL-1，在0.5～200 ng·mL-1質量濃度范圍內線性系數大于0.99，回收率為80%～120%。網格式固相微萃取是一種與氣流吹掃式常壓電離源有效結合的樣品富集方式，其性能與葉片式固相微萃取相似，是一種非常具有前景的復雜樣品富集技術。

圖4 網格式固相微萃取用于采樣和質譜分析過程示意圖Fig.4 Schematic diagram of mesh-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

5 表面涂層式固相微萃取

表面涂層式固相微萃取(Surface coating-based SPME)是將有機聚合物材料涂覆在金屬片或鋁箔上，然后進行固相微萃取和電噴霧電離的一種方式。Tian等[36]基于分子印跡對目標化合物獨特的識別能力，首先采用正硅酸乙酯和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷對不銹鋼等腰三角形金屬片進行修飾，然后利用原位共聚的方法將分子印跡聚合在金屬片表面，接著將制備好的分子印跡金屬片放入牛奶萃取液中對氟喹諾酮抗生素(如恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和培氟沙星等)進行富集和質譜分析(如圖5A)，檢出限可達0.1～2 ng·mL-1，回收率為78.8%～103%，RSD為4.5%～11%。So等[37]基于鋁箔膠帶表面膠的粘著性，將TiO2、C4、C8和C18等材料利用物理涂抹的方法涂覆在鋁箔膠帶的表面，以其為SPME固定相富集復雜生物基質中的溶菌酶、短桿菌肽D、β-D-吡喃葡萄糖苷和磷酸化肽，以及尿液中羥基多環(huán)芳烴化合物，隨后進行原位質譜分析(如圖5B)，發(fā)現該方法對生物基質中目標化合物具有很好的富集和分析效果。表面涂層式固相微萃取最大的優(yōu)勢是可通過改變涂覆材料性能來實現目標化合物的選擇性富集，這為復雜樣品中特定化合物的高靈敏分析提供了有效途徑。該技術今后發(fā)展的一個主要研究方向是發(fā)展新型、具有高效選擇性的分離富集材料。

圖5 表面涂層式固相微萃取用于采樣和質譜分析過程示意圖Fig.5 Schematic diagram of surface coating-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysisA:coated with molecularly imprinted polymer(分子印跡聚合物涂層);B:coated with adsorption materials(吸附材料層)

6 濾膜/濾紙分離式固相微萃取

為了克服復雜生物樣品分析過程中小分子和金屬鹽對待測生物大分子分析的干擾，Zhang等[38]基于紙噴霧電離源，提出了一種膜分離富集方式，該方式先將復雜的生物樣品加載在多孔濾膜的表面，再利用溶劑將樣品中的小分子和金屬鹽洗脫到底層的濾紙表面，最后加載噴霧溶劑于濾膜表面，使保留在濾膜表層的待測生物大分子得以高效電離分析(圖6)。采用這種方式，NaCl含量為1%～5%的細胞色素C的分析靈敏度提高了10～20 倍，檢出限相比于納升電噴霧電離源提升了10倍。為進一步提高分析性能，該研究小組將微滲析膜與抗體相結合，用于尿樣中細胞色素C的富集，發(fā)現相比于50 μg·mL-1納升電噴霧電離源的分析性能，采用這種膜富集方式的噴霧電離分析靈敏度提升了500倍，線性范圍介于10～1 250 ng·mL-1。該濾膜分離式SPME技術為生物復雜樣品的選擇性分離富集提供了新思路。

圖6 濾膜分離式固相微萃取用于采樣和質譜分析過程示意圖Fig.6 Schematic diagram of filter membrane separation-based SPME for sampling targets and mass spectrometric analysis

吸附劑材料由于具有獨特的表面性能，在分離分析方面發(fā)揮了重要作用。為了將吸附劑獨特的分離選擇性與常壓電離源(如紙噴霧電離源)相結合，本課題組最近發(fā)展了一種具有操作簡單、涂層可控的真空抽濾涂覆法[39]，采用該方法可將不同固體吸附劑(如金屬氧化物[40]、二氧化硅[41]、聚苯乙烯[42]等)涂覆在濾紙表面。通過對不同復雜生物樣品(如尿樣、血樣等)中藥物化合物在涂覆濾紙表面擴散行為的考察，發(fā)現藥物化合物更易富集在涂覆吸附劑的表面，而生物基質(如血樣)更易擴散到吸附劑的底端，這為復雜樣品中目標化合物的原位選擇性分離富集提供了有效策略。例如，采用ZrO2涂覆紙作為紙噴霧電離源基質時，其分析靈敏度相比于未經涂覆的濾紙?zhí)岣吡?3～189倍；相比于商品SG81濾紙和二氧化硅單面涂覆濾紙，其分析靈敏度提高了1.5～16.5倍[40]。當利用聚苯乙烯涂覆的濾紙作為紙噴霧電離源基質時，其檢出限可達0.004～0.084 ng·mL-1；同時發(fā)現聚苯乙烯材料的物理化學性質對紙噴霧過程中目標化合物的洗脫性能影響較大，聚苯乙烯的吸附性能越強，藥物化合物在其表面越容易解吸，進而促進了質譜對藥物化合物的高靈敏度分析[42]。以上研究表明，發(fā)展新型、高效的分離富集材料對于提高紙噴霧電離源在復雜生物樣品分析的性能方面起到了關鍵作用。

7 結論與展望

隨著分析技術的快速發(fā)展，人們對復雜樣品中目標化合物的分析提出了更高要求，固相微萃取-直接質譜分析技術不僅可從復雜樣品中萃取富集待測目標化合物，同時具有操作簡單、分析效率高等特點，現已在生物學、藥物化學、環(huán)境化學等領域發(fā)揮著重要作用。盡管如此，隨著新型固相微萃取材料和質譜電離源技術的逐步演變，該技術仍然存在如下挑戰(zhàn)：(1)微量/痕量樣品的高靈敏度分析。生命科學中的許多探索性研究均基于微量/痕量樣品(如單細胞或生理液體)的分析，但該過程不僅存在樣品量少、分析化合物濃度低的問題，同時樣品基質極其復雜，為此發(fā)展選擇性好、富集效率高的固相微萃取材料顯得格外重要；(2)縮短分析時間。對于單個樣品，目前相關技術的整個分析過程所需時間基本上大于2 min，不利于大量樣品的高通量分析，為此進一步簡化分析流程，提高樣品富集效率是今后的主要研究方向；(3)自動化操作。實現批量樣品的快速分析不僅可有效避免人為因素對分析結果的影響，也可提高分析效率，為此發(fā)展自動化的固相微萃取串聯質譜裝置，可極大地拓展該技術在不同領域的廣泛應用；(4)現場、原位分析。該技術現今仍局限于將待測樣品帶回到實驗室進行分析，不能實時反映樣品中待測化合物的實際情況，為此發(fā)展便攜式固相微萃取裝置與微型化質譜儀是今后的一個重要研究方向。固相微萃取-直接質譜分析技術基于自身的直接、方便、快捷等特點，以上問題的逐步解決將有助于其飛躍式發(fā)展。