胡莉莉，何芷晴，吳春梅，賈珊珊，楊玉磊，張 玫*，雷海民*

(1.北京市北分儀器技術(shù)有限責(zé)任公司，北京 100095；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000； 3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488)

質(zhì)譜(Mass spectrometry,MS)技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、分析速度快、樣品用量少等優(yōu)勢，目前在各個(gè)領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用[1-4]。離子源是質(zhì)譜的重要組成部件，2004年出現(xiàn)的敞開式離子化質(zhì)譜(Ambient ionization mass spectrometry,AI-MS)是離子化技術(shù)領(lǐng)域的重大突破。AI-MS技術(shù)可在大氣壓環(huán)境中直接對(duì)樣品或樣品表面物質(zhì)進(jìn)行分析，無需或只需很少樣品前處理步驟，具有實(shí)時(shí)、簡便、快速、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)。隨著AI-MS技術(shù)的不斷發(fā)展，其檢測靈敏度已逐漸可與傳統(tǒng)MS相媲美。目前，AI-MS已經(jīng)在食品藥品檢測、環(huán)境監(jiān)測、爆炸物檢測、分子成像等諸多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[5-6]。本文將重點(diǎn)介紹目前使用較為廣泛的AI-MS離子源及其在微生物分析中的應(yīng)用。

1 敞開式離子源的技術(shù)分類與原理特點(diǎn)

根據(jù)離子化原理與方法不同，AI-MS技術(shù)大體可分為噴霧型、放電型和以氣、熱等輔助激光解吸的復(fù)合型3類。下面對(duì)3類AI-MS技術(shù)裝置和原理的特點(diǎn)進(jìn)行介紹：

1.1 噴霧型敞開式離子化技術(shù)

噴霧型敞開式離子化技術(shù)通過溶劑蒸發(fā)和尖端效應(yīng)生成離子。Cooks團(tuán)隊(duì)發(fā)明的解吸電噴霧離子化(Desorption electrospray ionization,DESI)方法是噴霧型AI-MS技術(shù)的典型代表[7]，納噴解吸電噴霧離子化(Nanospray desorption electrospray ionization,nano-DESI)技術(shù)則具有更佳的檢測靈敏度。Prosolia公司于2005年將DESI商品化，如今已迭至第二代DESI 2D,并推出了Flowprobe對(duì)待測物質(zhì)進(jìn)行高效微萃取，現(xiàn)已成功應(yīng)用于疾病篩查與微生物分析。陳煥文教授提出了萃取電噴霧離子化(Extractive electrospray ionization,EESI)技術(shù)[8]，隨后又開發(fā)了中性萃取電噴霧離子化[9]技術(shù)，可分別實(shí)現(xiàn)復(fù)雜液體樣品和固體樣本的高時(shí)效性分析。目前DESI和EESI均已被應(yīng)用于微生物研究[10]，同時(shí)已基于EESI實(shí)現(xiàn)了多種技術(shù)延伸，比如小型化[11]和內(nèi)部萃取電噴霧離子化技術(shù)[12]的開發(fā)等。

Haddad提出的解吸聲波噴霧離子化(Desorption sonic-spray ionization,DeSSI)技術(shù)，即后來的簡易聲波噴霧離子化(Easy ambient sonic-spray ionization,EASI)[13]的裝置，與DESI類似但無需高溫高壓。類似的還有文丘里-簡易聲波噴霧離子化[14]和精簡型-簡易聲波噴霧離子化[15]。EASI類離子源不依賴于電子、輻射、光、熱組件，降低了儀器硬件成本，目前在多個(gè)領(lǐng)域均有應(yīng)用。紙噴霧離子化(Paper spray ionization,PSI)是最為簡易的常壓質(zhì)譜技術(shù)之一，歐陽證教授團(tuán)隊(duì)對(duì)紙基進(jìn)行了二氧化硅修飾[16]；本課題組采用商品化半透膜或合成的分子印跡膜代替原有的紙基發(fā)展出的膜噴霧(Membrane electrospray ionization,MESI)[17]和印跡膜噴霧(Molecularly imprinted membrane electrospray ionization,MIM-ESI)[18]，以及融入了納米技術(shù)的紙基修飾都進(jìn)一步提升了紙噴霧的分析能力[19-20]。目前基于紙噴霧、膜噴霧，已成功實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌種屬鑒別、細(xì)菌耐藥性快速檢測、細(xì)菌毒素快速檢測等多項(xiàng)微生物相關(guān)應(yīng)用[21-22]。

1.2 放電型敞開式離子化技術(shù)

放電型敞開式離子源的離子化機(jī)理主要包含“質(zhì)子轉(zhuǎn)移”和“電子轉(zhuǎn)移”等離子分子反應(yīng)過程。Cody團(tuán)隊(duì)提出的實(shí)時(shí)直接分析(Direct analysis in real time,DART)離子化技術(shù)是該類型的典型代表[23]。目前DART已實(shí)現(xiàn)商品化，在微生物鑒定方面顯示出快速、簡便、高通量的特征[24-25]。Cooks教授開發(fā)的低溫等離子體探針(Low temperature plasma,LTP)技術(shù)，可直接將固體基質(zhì)表面樣品分子解吸并電離進(jìn)行質(zhì)譜檢測[26]，并可應(yīng)用于mini-MS[27]。低溫等離子體對(duì)樣品損傷小，便于樣品表面的準(zhǔn)確定位，在質(zhì)譜成像和生物活體原位研究等領(lǐng)域具有重要價(jià)值。快速蒸發(fā)離子化質(zhì)譜技術(shù)(Rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)為生物組織實(shí)時(shí)體內(nèi)分析而設(shè)計(jì)[28]，有兩支鑷子形手持電極探針，可將微量細(xì)菌置于射頻電流下獲得微生物質(zhì)譜指紋圖譜。在REIMS基礎(chǔ)上發(fā)展而來的環(huán)境激光解吸離子化(Ambient laser desorption ionization,ALDI)技術(shù)在形態(tài)精度和分析通量上均得到了提高[29]。

1.3 以氣、熱等輔助激光解吸的復(fù)合型離子化技術(shù)

Shiea等[30]提出的電噴霧激光解吸離子化(Electrospray laser desorption ionization,ELDI)技術(shù)，是將激光解吸附和電噴霧相結(jié)合的電離策略，首次實(shí)現(xiàn)了無需基質(zhì)輔助僅利用激光解吸進(jìn)行完整的蛋白質(zhì)譜分析。Rezenom等[31]提出的紅外激光輔助解吸電噴霧離子化(Infrared laser-assisted desorption electrospray ionization,IR-LADESI)技術(shù)，多用于對(duì)生物液體樣品的分析。此外還有Sampson等[32]提出的具有更高靈敏度的基質(zhì)輔助激光解吸電噴霧離子化(Matrix-assisted laser-desorption electrospray ionization,MALDESI)技術(shù)，可同時(shí)滿足液體和固體樣品的檢測需求[33]，以及Nemes等[34]提出的采用不同激光源的激光消融電噴霧離子化(Laser ablation electrospray ionization,LAESI)技術(shù)等。基質(zhì)是一類對(duì)微生物生理生化等生物學(xué)過程影響很大的化學(xué)物質(zhì)，無需基質(zhì)輔助的質(zhì)譜離子化技術(shù)將大幅度擴(kuò)展質(zhì)譜技術(shù)在微生物領(lǐng)域的研究應(yīng)用。

2 敞開式離子化技術(shù)在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

近年來基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)已成功應(yīng)用于微生物鑒定[35]，然而尚無法實(shí)現(xiàn)快速分析，也缺乏菌株分型能力。隨著AI-MS的興起，其操作簡便、快速檢測的優(yōu)勢越發(fā)受到人們青睞，在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用不斷得到拓展，表1～3總結(jié)了目前已報(bào)道的應(yīng)用于微生物檢測的敞開式離子化方法。下面逐一詳細(xì)介紹。

2.1 微生物鑒定與分型

細(xì)菌的鑒定分型在臨床診斷、公共衛(wèi)生、環(huán)境檢測、藥學(xué)、食品等諸多領(lǐng)域具有重要意義。在噴霧型AI-MS技術(shù)中，DESI可在環(huán)境條件下從完整微生物中快速獲得細(xì)菌種屬鑒定結(jié)果實(shí)現(xiàn)亞種分類[36]。Hamid等[37-38]采用PSI-MS結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)算法在無需樣品制備的情況下，對(duì)細(xì)菌、真菌進(jìn)行了鑒定分類。Cooks課題組建立的接觸噴霧離子化(Touch-spray ionization,TSI)質(zhì)譜[39-40]、本課題組研發(fā)的注射器噴霧質(zhì)譜(Syringe spray mass spectrometry,SS-MS)方法[41]，均可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌種屬分類鑒定。SS-MS還可監(jiān)測細(xì)菌對(duì)外界刺激反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程，直接分析細(xì)菌對(duì)外界刺激做出的反應(yīng)。捕獲微生物對(duì)環(huán)境變化和刺激的動(dòng)態(tài)響應(yīng)對(duì)于理解微生物的適應(yīng)性和進(jìn)化非常重要，對(duì)于抗生素藥物開發(fā)和微生物組學(xué)研究具有實(shí)際意義。

細(xì)菌脂肪酸分析常被用于細(xì)菌鑒定[42]，敞開式離子化質(zhì)譜可分析細(xì)菌脂肪酸，無需樣本前處理。在放電型AI-MS技術(shù)中，Pierce等[43]采用DART-TOF MS對(duì)完整的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行了脂肪酸甲酯(Fatty acid methyl esters,FAME)離子化的研究；Cody[44]通過DART-TOF MS技術(shù)對(duì)17種不同的干酵母菌株進(jìn)行了區(qū)分。Musah等[45]利用DART-MS衍生指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理實(shí)現(xiàn)了物種識(shí)別和分類，僅根據(jù)微生物的代謝產(chǎn)物即可判斷物種間的相似性和差異性。Cooks課題組[46]通過采用LTP-MS直接檢測細(xì)菌樣品中的脂肪酸乙酯(Fatty acid ethyl esters,FAEE)，成功區(qū)分了16種不同細(xì)菌。Strittmatter等[47]就REIMS作為細(xì)菌和真菌通用鑒定系統(tǒng)的適用性進(jìn)行了研究，Cameron等[48]使用自動(dòng)化、高通量的REIMS智能平臺(tái)直接分析人類糞便樣本，鑒定到可能來自細(xì)菌的磷脂分子。

表1 用于微生物鑒定與分型的敞開式離子化方法Table 1 Ambient ionization methods for microbial classification and identification

2.2 微生物代謝物與生物膜分析

微生物代謝產(chǎn)物研究可助力藥物發(fā)現(xiàn)，目前基于DESI-MS開發(fā)了諸多應(yīng)用，例如：Cooks課題組成功鑒定到枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗生素環(huán)脂肽Surfacetin[49]；Pruski等[50]用棉簽拭子進(jìn)行了粘膜代謝組分析；Rodrigues等[51]進(jìn)行了放線菌次生代謝產(chǎn)物的表征;Lanekoff等[52]對(duì)瓊脂平板上粘球菌代謝物和脂質(zhì)的空間分布進(jìn)行了分子水平的研究;Rath等[53]開展了細(xì)菌代謝物的非靶向分析；Nguyen等[54]使用DESI-MS/MS技術(shù)將種屬特異性分子與相關(guān)基因功能形成聯(lián)系；Zhang等[55]直接測定了不同細(xì)菌的脂類。此外，Hsu等[56]采用Flowprobe-MS對(duì)30余種微生物代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，成功鑒定到包括不同種屬細(xì)菌的代謝產(chǎn)物。

生物膜又稱生物被膜，是微生物學(xué)領(lǐng)域的前沿之一。Ravindran等[57]采用銅綠假單胞桿菌為研究模型，建立了水中有毒重金屬污染的快檢方法。Li等[58]使用DART-MS檢測了醫(yī)療器械材料的內(nèi)毒素污染情況。

2.3 微生物質(zhì)譜成像

目前質(zhì)譜成像技術(shù)已成為質(zhì)譜研究的一大熱點(diǎn)。Yan等[59]使用直接生物轉(zhuǎn)化離子質(zhì)譜(Direct biotransformation-ion mobility mass spectrometry,DiBT-IMMS)方法對(duì)瓊脂平板細(xì)菌菌落進(jìn)行了分析。劉虎威教授團(tuán)隊(duì)利用EASI-MS描述了藍(lán)藻的衰老過程[60]。Angolini等[61]采用EASI-MS和DESI-MS在培養(yǎng)物表面直接進(jìn)行代謝產(chǎn)物的空間分布研究。李航等[62]采用LAESI-MS成像模擬了Kirby-Bauer實(shí)驗(yàn)中微生物與抗生素的相互作用，研究了抗生素對(duì)細(xì)菌生長的抑制作用。Stopka等[63]采用LAESI-IMS-MS方法對(duì)未感染根段和完整根瘤進(jìn)行了對(duì)比成像分析，揭示了關(guān)鍵代謝物在皮質(zhì)和感染區(qū)域的空間分布。

表2 用于微生物代謝物和生物膜分析的敞開式離子化方法Table 2 Ambient ionization methods for bacterial metabolite analysis and biofilm analysis

表3 用于微生物質(zhì)譜成像的敞開式離子化方法Table 3 Ambient ionization methods for mass spectrometry imaging of microbial

3 總結(jié)與展望

目前基于微生物自身的分子特征，研發(fā)具有針對(duì)性的新型敞開式電離技術(shù)是質(zhì)譜領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。敞開式離子化質(zhì)譜技術(shù)由于具有原位無損分析和快速便捷等諸多優(yōu)點(diǎn)，很大程度上契合了微生物研究的需求，展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景。但目前的技術(shù)多數(shù)仍受制于質(zhì)譜設(shè)備的龐大體積和高昂成本?，F(xiàn)今，敞開式離子化技術(shù)結(jié)合便攜式質(zhì)譜儀已成為質(zhì)譜快速分析的重要發(fā)展方向，為質(zhì)譜的現(xiàn)場普查篩選應(yīng)用提供了可能。