高海燕，孟憲雙，付珺珺，王松瑩，馬 強(qiáng)*

(1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070)

質(zhì)譜作為一種高選擇性和高靈敏度的定性定量分析技術(shù)，當(dāng)前已成為許多學(xué)科的重要分析工具[1]。質(zhì)譜分析依靠各種電離技術(shù)將樣品分子轉(zhuǎn)化成帶電離子，并利用適當(dāng)電場(chǎng)和磁場(chǎng)實(shí)現(xiàn)不同質(zhì)荷比離子的分離，進(jìn)而檢測(cè)離子強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。其中，電離技術(shù)作為質(zhì)譜分析中的前端關(guān)鍵技術(shù)，直接關(guān)乎樣品的電離效率，對(duì)質(zhì)譜儀的性能提升和應(yīng)用范圍具有至關(guān)重要的推動(dòng)作用。目前，常規(guī)電離技術(shù)主要包括電噴霧電離(Electrospray ionization,ESI)、大氣壓化學(xué)電離(Atmospheric pressure chemical ionization,APCI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(Matrix-assisted laser desorption/ionization,MALDI)、電子轟擊(Electron ionization,EI)和化學(xué)電離(Chemical ionization,CI)等，它們均與質(zhì)譜儀在線耦合，對(duì)預(yù)處理過的樣品在一相對(duì)封閉的空間內(nèi)進(jìn)行電離。

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)和相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，質(zhì)譜分析不斷面臨新的挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)質(zhì)譜分析方法在應(yīng)對(duì)復(fù)雜樣品檢測(cè)時(shí)逐漸表現(xiàn)出短板，繁雜而耗時(shí)的提取、分離、濃縮、凈化等樣品前處理過程往往降低和制約著分析效率。近年來，無需復(fù)雜樣品前處理的原位電離(Ambient ionization,AI)技術(shù)成為質(zhì)譜分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，AI具有操作簡(jiǎn)便、分析速度快、機(jī)動(dòng)性強(qiáng)(與便攜式質(zhì)譜聯(lián)用時(shí))、綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，在組織樣本原位分析、復(fù)雜樣品直接分析及表面分析等方面均取得了重大研究進(jìn)展，大大拓展了質(zhì)譜分析的應(yīng)用領(lǐng)域[2-11]。以2004年Cooks等[12]研發(fā)的解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization,DESI)和2005年Cody等[13]研發(fā)的實(shí)時(shí)直接分析(Direct analysis in real time,DART)電離技術(shù)為代表，各種新型原位電離質(zhì)譜技術(shù)如雨后春筍般涌現(xiàn)，如紙噴霧電離(Paper spray ionization,PSI)[14-15]、探針電噴霧電離(Probe electrospray ionization,PESI)[16-17]、介質(zhì)阻擋放電電離(Dielectric barrier discharge ionization,DBDI)[18-19]、萃取電噴霧電離(Extractive electrospray ionization,EESI)[20-21]、牙簽噴霧電離(Wooden tip spray,WTS)[22]、涂層刀片噴霧電離(Coated blade spray,CBS)[23]、解吸聲波噴霧電離(Desorption sonic spray ionization,DeSSI)[24]、空氣動(dòng)力輔助電離(Air flow assisted ionization,AFAI)[25]、熔滴電噴霧萃取電離(Fused droplet electrospray ionization,FDESI)[26]、組織噴霧電離(Tissue spray ionization,TSI)[27]等，這些原位電離技術(shù)除本身具備的實(shí)時(shí)、在線、活體分析等特性外，與小型裝置的智能耦聯(lián)將使現(xiàn)場(chǎng)快速分析變得前景廣闊。

2009年，Takáts等[28]基于電外科和激光外科手術(shù)方式使生物組織快速熱蒸發(fā)，產(chǎn)生大量組織源性信息的氣體分子，從而提出利用快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜(Rapid evaporative ionization mass spectrometry,REIMS)技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)、原位組織分析。REIMS技術(shù)采用一種創(chuàng)新性手持式采樣技術(shù)，通過電離切割組織樣本釋放氣溶膠，然后經(jīng)導(dǎo)管將氣溶膠直接吸入質(zhì)譜儀檢測(cè)。從樣品切割到生成數(shù)據(jù)僅需幾秒，可實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)志性差異成分的鑒定。它消除了與樣品制備相關(guān)的諸多限制，可在數(shù)秒內(nèi)為分析人員提供具有樣品高度特征性的精確分子輪廓圖，可用作鑒定關(guān)鍵屬性的“指紋”，反映樣品的真實(shí)性、物種、質(zhì)量或表型特征。本文綜述了REIMS技術(shù)的發(fā)展歷程、工作流程、電離機(jī)制以及近年來在醫(yī)學(xué)、微生物鑒定、食品真?zhèn)舞b別、代謝物研究、藥用植物成分鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展，并對(duì)其前景進(jìn)行了展望。

圖1 早期REIMS組織分析實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖[28]Fig.1 Schematic diagram of experimental setup of early REIMS for tissue analysis[28]

1 發(fā)展歷程

組織樣本中生物分子的質(zhì)譜分析通常采用解吸附電離，如二次離子質(zhì)譜(Secondary ion mass spectrometry,SIMS)[29-35]、MALDI[36-42]和DESI[12,43]。然而，解吸附電離技術(shù)對(duì)重要的活體組織分析并不能完全勝任?；铙w組織的快速加熱過程使分子蒸發(fā)速率與分解速率相當(dāng)，從而可形成大量氣態(tài)分子或分子離子[28]，因此具備組織成分原位、體內(nèi)快速蒸發(fā)電離的可能性。最初，Holland等[44]提出在傳熱過程中，凝聚相樣品可能形成有機(jī)離子，后來通過實(shí)驗(yàn)得到了證明[45-47]。因此，對(duì)高效熱蒸發(fā)技術(shù)的探索研究直接推動(dòng)了各種熱輔助電離技術(shù)的發(fā)展，包括熱噴霧電離(Thermospray ionization,TSI)[48]等。大氣壓下的熱蒸發(fā)有望抑制熱分解，并已被證明是組織樣本中有機(jī)陽離子解吸附最低的熱降解條件[49]?；谏锝M織快速熱蒸發(fā)能夠產(chǎn)生含有組織成分(如磷脂)的氣態(tài)分子離子以及電外科和激光手術(shù)在剝蝕或解剖組織時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有生物特征煙霧的現(xiàn)象，2009年，Takáts等[28]首次將手術(shù)工具與質(zhì)譜儀結(jié)合(圖1)，對(duì)豬腎臟組織進(jìn)行分析，采用質(zhì)譜庫和主成分分析(Principal component analysis,PCA)開發(fā)了一套組織識(shí)別系統(tǒng)，為手術(shù)中組織的原位分析提供了可能，并將該技術(shù)命名為REIMS。在隨后的十余年里該技術(shù)得到了迅速發(fā)展，并于2014年被Waters公司收購實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。商業(yè)化的REIMS設(shè)備增加了輔助溶劑注射泵和源箱內(nèi)通電流的高溫發(fā)熱體，有效提高了電離效率和穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高了數(shù)據(jù)質(zhì)量。目前，該設(shè)備以“僅供研究”的形式銷售，應(yīng)用范圍越來越廣，涉及醫(yī)學(xué)組織鑒定、微生物鑒定、食品真?zhèn)舞b定、代謝物研究、藥用植物成分鑒定等多個(gè)領(lǐng)域。

2 整機(jī)設(shè)備及工作流程

2.1 整機(jī)設(shè)備

由于組織的熱蒸發(fā)現(xiàn)象在外科手術(shù)(如電外科和激光手術(shù))過程中較為常見，最初的REIMS實(shí)驗(yàn)裝置以外科手術(shù)器械作為離子源與質(zhì)譜儀遠(yuǎn)程結(jié)合(圖2A)。利用改進(jìn)的外科手術(shù)器械作為樣品處理探頭直接向生物組織施加高頻電流或激光照射，使組織快速受熱，沿著手術(shù)器械的接觸面快速蒸發(fā)，產(chǎn)生含有正負(fù)離子及中性粒子的氣溶膠。借助文丘里泵和一根長(zhǎng)2米、直徑1/8英寸的聚四氟乙烯管(圖2B)，將氣溶膠輸送到質(zhì)譜儀入口。文丘里泵被安裝在源箱中，由400 kPa額定壓力的氮?dú)怛?qū)動(dòng)，與質(zhì)譜儀的加熱毛細(xì)管入口垂直，以減少對(duì)大氣界面的污染(圖2C)。市面上用于排出有毒外科煙霧的裝置，由于死體積大和樣品被稀釋等原因不適合離子的轉(zhuǎn)移,而聚四氟乙烯(PTFE)管可在1～3米距離內(nèi)傳輸離子，同時(shí)還能保留足夠的離子數(shù)量用于質(zhì)譜分析。選擇2米聚四氟乙烯管遠(yuǎn)程分析，可實(shí)現(xiàn)較短的傳輸時(shí)間，同時(shí)避免實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)之間的交叉污染。早期的REIMS研究采用高分辨質(zhì)譜儀分析，通過精確質(zhì)量測(cè)定來識(shí)別未知物的質(zhì)譜特征，使用離子阱質(zhì)譜儀和四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行菌株的盲樣識(shí)別均可達(dá)到97%以上的正確率，而且快速蒸發(fā)電離與不同質(zhì)譜儀結(jié)合得到的質(zhì)譜輪廓也具有較高的重現(xiàn)性[50]。

圖2 早期REIMS設(shè)備裝置示意圖[51]Fig.2 Schematic diagram of the early REIMS device[51]

圖3 iKnife集成快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜裝置示意圖Fig.3 Schematic diagram of the iKnife-REIMS system

隨著REIMS技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)的發(fā)明者帝國理工學(xué)院Takáts教授和Waters公司合作開發(fā)的商業(yè)化REIMS設(shè)備得到了進(jìn)一步完善(圖3)，該裝置使用VIO 50C型高頻發(fā)生器(可通過設(shè)置功率調(diào)節(jié)電流)，集成iKnife手持式采樣探頭，在分析物氣溶膠中引入2-丙醇作為輔助溶劑，提高了方法的檢測(cè)靈敏度。通過去除儀器毛細(xì)管入口處的固體沉淀物，減少了質(zhì)譜儀的污染，同時(shí)允許使用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行精確的實(shí)時(shí)質(zhì)量校正[52]。此外，在質(zhì)譜儀部分，使用了改進(jìn)的大氣壓界面，使液滴與一個(gè)恒定電流的高溫(～900 ℃)發(fā)熱體碰撞后進(jìn)入四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，整個(gè)過程僅需數(shù)秒鐘，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件即可實(shí)現(xiàn)樣品的實(shí)時(shí)鑒定分析。

2.2 加熱方式

一般而言，快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜法涵蓋了所有使凝聚相樣品快速熱誘導(dǎo)分解產(chǎn)生氣態(tài)離子的方法。從這個(gè)角度上來看，加熱方法有焦耳加熱、接觸加熱和輻射加熱等許多不同的實(shí)現(xiàn)方式。

2.2.1 焦耳加熱電外科加熱技術(shù)是一組利用高頻電流焦耳加熱進(jìn)行組織剝蝕切割的操作方法。iKnife采用單極或雙極透熱手持探頭(圖4)對(duì)樣品直接施加高頻電流(在電極和樣品之間能夠觀察到，不適用于非導(dǎo)電樣品)。焦耳加熱過程中因生物組織內(nèi)存在一定的阻抗而引起電能的耗散從而造成了組織的熱損傷，其主要的組織蒸發(fā)機(jī)制包含水分的迅速沸騰、蛋白質(zhì)的變性/沉淀、細(xì)胞膜的崩解和飽含細(xì)胞碎片的水滴的形成[53-54]。在使用單極手持探頭切割樣品時(shí)，將整個(gè)樣品置于返回電極(導(dǎo)電材料)之上，高頻電流在一個(gè)閉合回路中流動(dòng)，即從發(fā)電設(shè)備到單極切割電極，通過樣品后到達(dá)返回電極，再從返回電極回到發(fā)電裝置。在切割過程中，電極作用的樣品局部為高密度電流，能夠使樣品快速蒸發(fā)，而其他接觸到返回電極的樣品表面為低密度電流，幾乎不受熱，因此，單極手持探頭的優(yōu)勢(shì)主要在于操作簡(jiǎn)便；雙極手持探頭多采用一對(duì)手持式雙電極，多為鑷子形狀，有兩個(gè)電極尖端，不需要返回電極。雙極探頭在切割樣品時(shí)，電流只在兩電極尖端之間的組織區(qū)域流動(dòng)而不流經(jīng)整個(gè)樣品，電流分布更均勻，離子生成率較單極探頭方式低，在分析少量生物樣本時(shí)，較單極裝置更具優(yōu)勢(shì)(圖5)。

圖4 REIMS采樣裝置示意圖Fig.4 Schematic diagram of the sampling device of the REIMS equipment

圖6 激光探針-快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜設(shè)備示意圖[58]Fig.6 Schematic diagram of laser-assisted REIMS equipment[58]

2.2.2 輻射加熱輻射加熱包括均勻的紅外激光剝蝕和激光解吸電離。激光手術(shù)是激光技術(shù)最早的應(yīng)用之一，早在1960年已有相關(guān)報(bào)道[55-57]。在REIMS技術(shù)的早期研究中，使用激光照射(圖6)使生物組織細(xì)胞內(nèi)部分子吸收激光能量[58]，實(shí)現(xiàn)局部加熱，從而產(chǎn)生大量的組織源性氣態(tài)離子。激光解吸電離可獲得與電外科焦耳加熱電離方式高度相似的質(zhì)譜圖[51](圖7)。

2.2.3 接觸加熱對(duì)于不導(dǎo)電的樣品可采用電烙鐵設(shè)備實(shí)現(xiàn)樣品的快速蒸發(fā)。目前REIMS方法中使用的電烙鐵設(shè)備通常由控制臺(tái)、電烙鐵、烙鐵架構(gòu)成。取樣時(shí)，高溫的電烙鐵探針與樣品直接接觸，約0.5 s即可產(chǎn)生一股氣溶膠，同時(shí)將連接質(zhì)譜儀的聚四氟乙烯管置于電加熱探針與樣品接觸位置上方，使含有豐富化合物信息的氣溶膠直接吸入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析[59-60](圖8)。

圖8 REIMS工作流程示意圖[60]Fig.8 Workflow diagram of REIMS[60]

2.3 工作流程

REIMS的一般工作流程為研究人員根據(jù)樣品性質(zhì)選擇適合的采樣裝置進(jìn)行切割，產(chǎn)生的氣溶膠被吸入REIMS源，經(jīng)充分電離后進(jìn)入質(zhì)譜儀獲得特異性的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)過程中需優(yōu)化儀器參數(shù)，選擇最優(yōu)儀器條件對(duì)樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)樣品屬性及特異性指紋譜圖數(shù)據(jù)建立分類模型，再對(duì)盲樣進(jìn)行檢測(cè)獲得實(shí)時(shí)的樣品屬性鑒定結(jié)果(圖8)。

圖9 不同的加熱方式所得質(zhì)譜圖(A)及快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)源區(qū)的示意圖(B)和(C)[52]Fig.9 Mass spectrometric characteristics of different heating methods(A) and a simplified illustration of the source region of REIMS experiment(B and C)[52]

3 電離機(jī)制

2009年，Takáts等[28]闡述了快速蒸發(fā)電離技術(shù)的離子形成機(jī)制。電外科設(shè)備進(jìn)行組織剝蝕的機(jī)理是通過電流對(duì)導(dǎo)電組織進(jìn)行焦耳加熱，導(dǎo)致水分的蒸發(fā)和電離、蛋白分子的變性、沉淀及膜的溶解，最后由于強(qiáng)烈的空化作用和氣泡的爆破使組織碎裂，形成霧化現(xiàn)象。在這種情況下，離子的生成可能遵循兩種不同的機(jī)制：第一種機(jī)制是在電外科切割組織的過程中，中性分子解吸出來后通過與電離的水分子反應(yīng)進(jìn)行氣相電離，因此大量電離水分子的存在是維持剝蝕過程的必要條件；這種機(jī)理與大氣壓化學(xué)電離機(jī)理非常相似。另一種機(jī)制是熱誘導(dǎo)機(jī)理，這種機(jī)理認(rèn)為在組織材料的快速熱蒸發(fā)過程中會(huì)生成富含磷脂的液滴。與聲波噴霧的氣泡實(shí)驗(yàn)類似，既能生成中性液滴，也會(huì)生成帶電液滴。液滴通過蒸發(fā)進(jìn)一步分裂和濃縮，產(chǎn)生帶電荷的磷脂團(tuán)簇，磷脂團(tuán)簇可進(jìn)一步解離形成單個(gè)磷脂分子離子。同時(shí)，由于切割過程中蒸發(fā)和熱降解同時(shí)發(fā)生，因此在質(zhì)譜中能夠同時(shí)觀察到樣品中磷脂成分的完整分子離子及其降解產(chǎn)物的離子信息。這種電離機(jī)理類似于燈絲關(guān)閉模式下的熱噴霧電離[48,61]。2010年，Takáts等[51]為進(jìn)一步闡明離子形成機(jī)理，研究了無放電過程中的組織蒸發(fā)方法，利用激光剝蝕和接觸加熱的單純加熱方式，得到了與電外科設(shè)備焦耳加熱過程相似的質(zhì)譜圖(圖9)，表明這兩種快速蒸發(fā)方式與電外科設(shè)備切割樣品的離子形成過程遵循相似的機(jī)理，在電極與組織表面之間所觀察到的射頻電弧對(duì)離子形成的貢獻(xiàn)較小，進(jìn)一步支持了熱誘導(dǎo)離子形成機(jī)制的假設(shè)。

此外，與其它將樣品引入質(zhì)譜儀的方式一樣，只有當(dāng)液滴(或團(tuán)簇)在離子源區(qū)域內(nèi)被充分蒸發(fā)釋放出單個(gè)分子離子時(shí)，才能在質(zhì)譜中看到分子離子信號(hào)。隨著快速蒸發(fā)電離技術(shù)的發(fā)展，目前商品化的REIMS采用iKnife或電烙鐵等設(shè)備切割或接觸樣品，迅速產(chǎn)生了含有豐富化合物分子或離子信息的氣溶膠，并將其引入REIMS源中與霧化的輔助溶劑混合，隨后與通電流的高溫發(fā)熱體表面發(fā)生碰撞(圖9)。該設(shè)計(jì)使氣溶膠中的分析物在有機(jī)溶劑中適當(dāng)溶解，有助于混合物中超分子團(tuán)簇撞擊、去溶劑化、充分釋放單個(gè)分子離子，同時(shí)促進(jìn)樣品氣溶膠中性粒子的熱電離，進(jìn)而提高離子產(chǎn)率[52]。

4 應(yīng)用研究進(jìn)展

REIMS技術(shù)憑借無需任何萃取或凈化程序即可快速對(duì)不同樣品進(jìn)行表征的優(yōu)異性能，目前已在許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中部分典型應(yīng)用實(shí)例見表1。

表1 快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜技術(shù)典型應(yīng)用實(shí)例Table 1 Typical applications of REIMS

(續(xù)表1)

4.1 醫(yī)學(xué)組織鑒定

電外科手術(shù)器械和質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合為手術(shù)中組織的原位化學(xué)分析提供了可能，REIMS技術(shù)興起之初就在醫(yī)學(xué)外科領(lǐng)域展現(xiàn)出應(yīng)用潛力。Takáts等[62]采用電外科設(shè)備結(jié)合質(zhì)譜，分析了302名患者的多種組織樣本，得到1 624個(gè)惡性和1 309個(gè)非惡性樣本數(shù)據(jù)。這項(xiàng)技術(shù)隨后被應(yīng)用于手術(shù)室，與現(xiàn)有的電外科設(shè)備相連接，在81次手術(shù)中進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。采用多元統(tǒng)計(jì)方法分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，精確區(qū)分了不同的組織和組織病理類型。術(shù)中REIMS的組織鑒定結(jié)果與術(shù)后組織學(xué)診斷符合率達(dá)100%；質(zhì)譜圖反映了不同組織學(xué)腫瘤類型以及原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的脂質(zhì)體特征，疑似惡性的組織特征均被檢出，可立即做出切除決定，為進(jìn)一步發(fā)展質(zhì)譜技術(shù)指導(dǎo)下的外科手術(shù)方法奠定了基礎(chǔ)。該方法已成功應(yīng)用于腫瘤切除術(shù)中惡性組織(包括轉(zhuǎn)移瘤)的定位。Takáts等[63-64]利用REIMS與內(nèi)鏡下的息肉切除圈套相結(jié)合，在體內(nèi)測(cè)試了這種新的內(nèi)窺鏡結(jié)合REIMS技術(shù)的分類性能。根據(jù)體內(nèi)每種組織的REIMS指紋圖譜，該技術(shù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分腸壁的健康層、癌癥和腫瘤淋巴結(jié)。Takáts等[65]采用REIMS技術(shù)對(duì)癌細(xì)胞系進(jìn)行了快速質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了類間差異和類內(nèi)差異的程度。隨后，對(duì)NCI60細(xì)胞系組進(jìn)行REIMS分析，并對(duì)所得數(shù)據(jù)集進(jìn)行研究，以區(qū)分單個(gè)細(xì)胞系和不同的組織來源類型，最終證明REIMS可檢測(cè)因支原體感染引起的細(xì)胞系脂質(zhì)含量的變化，是一種極具潛力的細(xì)胞系研究方法。John等[66]基于脂質(zhì)代謝的細(xì)微變化，對(duì)異質(zhì)性乳腺組織進(jìn)行實(shí)時(shí)iKnife-REIMS分析，理論驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示該方法能夠在術(shù)中在線收集和分析數(shù)據(jù)，但仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證研究來確定術(shù)中REIMS用于腫瘤邊緣評(píng)估的準(zhǔn)確性。Phelps等[67]對(duì)198名患者提供的335份組織樣本進(jìn)行REIMS分析，經(jīng)交叉驗(yàn)證，卵巢癌組織與正常組織的分類敏感性和特異性可分別達(dá)到97.4%和100%，卵巢腫瘤與卵巢癌組織的分類敏感性和特異性分別可達(dá)90.5%和89.7%。Mason等[68]使用REIMS對(duì)直腸組織中的脂類進(jìn)行化學(xué)分析，根據(jù)潛在的脂質(zhì)生物學(xué)差異來區(qū)分直腸組織類型，對(duì)提高早期直腸癌切除術(shù)的療效以及直腸癌組織切除的質(zhì)量有一定的作用，有望為外科手術(shù)提供有效臨床數(shù)據(jù)。

4.2 微生物鑒定

Takáts等[69]將細(xì)菌樣本置于射頻電流下，直接從完整的細(xì)菌細(xì)胞中獲得REIMS指紋圖譜。微生物樣本因其非零阻抗而迅速升溫，熱誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂導(dǎo)致產(chǎn)生含有代謝物和結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的氣溶膠，氣溶膠可直接引入質(zhì)譜儀進(jìn)行在線化學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)中對(duì)單極和雙極采樣裝置的適用性進(jìn)行了測(cè)試。兩種裝置均能產(chǎn)生完整細(xì)菌細(xì)胞的指紋圖譜。根據(jù)9種細(xì)菌在不同生長(zhǎng)介質(zhì)上的質(zhì)譜指紋圖譜，建立分類模型，并對(duì)9種細(xì)菌進(jìn)行了科、屬和種的鑒定。Takáts等[50]利用雙極鉗子作為取樣探針結(jié)合REIMS對(duì)28株臨床相關(guān)菌株進(jìn)行負(fù)離子模式分析，并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)分類模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證，在物種、屬和革蘭染色水平上分別獲得了95.9%、97.8%和100%的正確率。對(duì)在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌株進(jìn)行盲樣鑒定實(shí)驗(yàn)，并使用不同儀器平臺(tái)進(jìn)行了分析，鑒定正確率為97.8%～100%。對(duì)7株不同的大腸桿菌在不同培養(yǎng)條件下進(jìn)行鑒定，準(zhǔn)確率為88%。此外，在不改變實(shí)驗(yàn)流程的情況下，該技術(shù)可用于5種致病念珠菌的鑒別，準(zhǔn)確率為98.8%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明了REIMS特異性強(qiáng)，可作為一種有效的微生物鑒定工具。該團(tuán)隊(duì)隨后開發(fā)了一種自動(dòng)化、高通量的適合臨床微生物實(shí)驗(yàn)室使用的REIMS平臺(tái)，通過分析從不同患者樣本中收集的25種微生物的375個(gè)不同臨床分離菌株，測(cè)試了該平臺(tái)對(duì)臨床重要微生物種類的鑒別能力，其中手持式雙極探針和高通量探針的精度分別達(dá)到96.3%和93.9%。因此，該技術(shù)可在實(shí)驗(yàn)室中快速準(zhǔn)確鑒定臨床重要微生物，而無需任何分析前的準(zhǔn)備步驟[70-71]。該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)對(duì)尖電極和圓形電極進(jìn)行了優(yōu)化，開發(fā)了圓管形電極，以增加與微生物生物量的接觸面，從而最大限度地提高氣溶膠產(chǎn)量進(jìn)而提高物種級(jí)別的分類精度。優(yōu)化后的REIMS電極在兩種極性檢測(cè)模式下物種級(jí)別的識(shí)別精度均得到了顯著提高。Bardin等[72]對(duì)來自囊性纖維化患者的45株銅綠假單胞菌進(jìn)行了代謝組分分析，并與80株非囊性纖維化患者銅綠假單胞菌進(jìn)行比較。其中磷脂的信號(hào)強(qiáng)度最高，檢出17種鼠李糖脂和18種群體感應(yīng)分子，表明REIMS在研究細(xì)菌毒性相關(guān)代謝物方面具有潛力。

4.3 食品品質(zhì)分析及真?zhèn)舞b別

化學(xué)成分篩選對(duì)于確保食品安全至關(guān)重要，雖然REIMS技術(shù)最初是為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用而開發(fā)，但后來也被證明是一種有價(jià)值的食品分析工具。Black等[73]將REIMS技術(shù)應(yīng)用于5種基因相似的白魚，對(duì)99份實(shí)際樣品的鑒定準(zhǔn)確性可達(dá)98.99%，而且速度極快(約2 s)，可與任何其它形式的食品鑒別分析技術(shù)相媲美。Verplanken等[74]采用REIMS進(jìn)行豬頸部脂肪中異味的快速檢測(cè)。對(duì)150例樣本進(jìn)行非靶標(biāo)篩查，基于采集的REIMS數(shù)據(jù)所建立的模型對(duì)母豬和公豬樣本的分類準(zhǔn)確率為99%，首次實(shí)現(xiàn)了有異味和無異味野豬樣品的快速、高精度、高通量分類。Guitton等[75]采用REIMS與非靶向代謝組學(xué)結(jié)合，基于間接代謝物脂質(zhì)圖譜的改變，對(duì)β-激動(dòng)劑處理的家畜肉樣進(jìn)行了直接分析和識(shí)別，分類準(zhǔn)確率大于95%，完全符合篩選策略的要求，可準(zhǔn)確、快速地測(cè)定動(dòng)物在繁殖過程中接觸萊克多巴胺的狀況。Balog等[76]使用REIMS裝置在不到5 s時(shí)間內(nèi)采集了肉制品(鹿肉、馬肉、牛肉)樣本的指紋圖譜并識(shí)別出不同品種和不同物種的動(dòng)物組織，物種識(shí)別準(zhǔn)確率為100%，品種識(shí)別準(zhǔn)確率為97%。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該技術(shù)對(duì)其它物種的肉類的識(shí)別也具有較高的準(zhǔn)確性。Song等[77]開發(fā)了一種使用iKnife和基于脂質(zhì)組學(xué)的REIMS方法來實(shí)時(shí)鑒別三文魚和虹鱒魚。研究中共鑒定出12種脂肪酸和37種磷脂，利用統(tǒng)計(jì)分析建立了原位和實(shí)時(shí)識(shí)別模型，有助于揭示魚肉種類的特性。隨后，采用iKnife-REIMS技術(shù)結(jié)合脂質(zhì)組學(xué)對(duì)金槍魚品種進(jìn)行了原位實(shí)時(shí)鑒定，并采用電烙鐵集成REIMS技術(shù)對(duì)魚油、南極磷蝦油貯藏過程中的氧化特性進(jìn)行了原位監(jiān)測(cè)[59-60，78]，為魚品種識(shí)別及市場(chǎng)上的摻假評(píng)價(jià)提供了重要依據(jù)。Gredell等[79]根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部對(duì)牛肉質(zhì)量等級(jí)、生產(chǎn)背景、品種類型和肌肉嫩度的要求，比較了8種不同的統(tǒng)計(jì)算法并生成預(yù)測(cè)模型，利用REIMS數(shù)據(jù)對(duì)牛肉品質(zhì)屬性進(jìn)行分類。結(jié)果表明，最優(yōu)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算方法根據(jù)分類問題的不同而不同，用一刀切的方法評(píng)價(jià)REIMS數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)模型是不合適的。Rigano等[80]利用REIMS技術(shù)建立了18種來自墨西拿海峽一塊很小區(qū)域海洋物種的數(shù)據(jù)庫，每個(gè)物種均獲得了可靠的鑒定，置信度大于99%。并通過主成分分析和線性判別分析，建立了一個(gè)大模型和3個(gè)子模型，對(duì)每個(gè)類(如頭足類)、目(如鱸形目)或科(如鯽科)的關(guān)鍵變量進(jìn)行了準(zhǔn)確識(shí)別。綜上，REIMS技術(shù)為食品安全及真假鑒別的快速鑒定提供了一種可靠且相對(duì)簡(jiǎn)單的解決方案。

4.4 代謝物研究

目前，REIMS研究對(duì)象大多為生物個(gè)體、組織或代謝物，Cameron等[81]建立了一個(gè)自動(dòng)化、高通量的REIMS平臺(tái)用于人類糞便的直接分析并優(yōu)化了分析參數(shù)。通過對(duì)5名健康男性受試者糞便樣品的分析，鑒定出膽汁酸和磷脂標(biāo)志物，并利用優(yōu)化的REIMS參數(shù)對(duì)減肥手術(shù)患者的糞便樣本進(jìn)行了分析，表明REIMS具有檢測(cè)臨床干預(yù)引起的生物變化的分析敏感性。Davidson等[82]基于REIMS分析了5種不同嚙齒類動(dòng)物的糞便顆粒，然后利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立分類模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論糞便來自于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的動(dòng)物還是捕獲的野生動(dòng)物，采用該方法均可以較高的準(zhǔn)確率對(duì)物種進(jìn)行分類，為糞便樣品的快速分析提供了一種全新方法。Lin等[83]建立了一種快速REIMS方法，人工模擬口腔、胃和腸道消化，在體外追蹤草魚多階段消化過程中的脂質(zhì)體。結(jié)果表明，在粗消化和多階段消化樣品中以磷脂為主，酶對(duì)磷脂的影響因磷脂種類而不同，磷脂的水解速率隨著?；湶伙柡统潭鹊脑黾佣黾印Ｔ摲椒ㄔ谌梭w胃腸道消化吸收特征的快速脂質(zhì)組學(xué)分析領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。Wijnant等[84]提出了唾液代謝組學(xué)的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(Ultra-high-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry,UHPLC-HRMS)分析方法。在青少年超重的臨床背景下，該方法能夠定義唾液中生物學(xué)相關(guān)代謝物譜(鑒定出129種代謝物，其中45種被認(rèn)為與肥胖有關(guān))和指紋譜(檢出6 500種代謝物)，具有發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物和闡明途徑的潛力。唾液可作為醫(yī)療領(lǐng)域中一種有價(jià)值的研究基質(zhì)。該研究提出的唾液代謝組學(xué)激光輔助-快速蒸發(fā)電離質(zhì)譜(Laser-assisted rapid evaporative ionization mass spectrometry,LA-REIMS)概念，與UHPLC-HRMS代謝物的覆蓋范圍相當(dāng)，且LA-REIMS可根據(jù)體重狀況實(shí)現(xiàn)分化。因此，該研究為唾液代謝組學(xué)提供了一個(gè)有效的UHPLC-HRMS和LA-REIMS的互補(bǔ)平臺(tái)，為深入進(jìn)行唾液代謝機(jī)理研究和快速鑒別指紋提供了技術(shù)參考。

4.5 藥用植物成分鑒定

市面上約60%的抗腫瘤和抗感染藥物來自天然產(chǎn)物[85]。Arena等[86]采用REIMS結(jié)合iKnife技術(shù)，未經(jīng)任何萃取和凈化過程即獲得了非洲吊燈樹果的代謝圖譜，從而將該技術(shù)應(yīng)用于植物化學(xué)成分研究。通過利用四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜與iKnife結(jié)合的優(yōu)勢(shì)，對(duì)這種植物物種進(jìn)行了全面分析，結(jié)果鑒定出酚類、脂肪酸類、磷脂類等78種生物分子。過去這種水果因其類似藥物的特性引起人們的特別關(guān)注，例如，可用于治療不育、糖尿病及炎癥、抗腫瘤、抗真菌和細(xì)菌感染等，這些特性均與酚類化合物相關(guān)。其中天然脂質(zhì)成分為首次報(bào)道，為活性化合物的檢測(cè)提供了新方向。

5 總結(jié)及展望

REIMS技術(shù)作為一種新型原位電離技術(shù)最初主要被用于醫(yī)學(xué)組織的原位、實(shí)時(shí)、快速鑒定。近年來，隨著REIMS裝置“電離技術(shù)”的精細(xì)化設(shè)計(jì)與商品化，該技術(shù)逐漸廣泛應(yīng)用于微生物分析、食品真?zhèn)舞b定、代謝物鑒定、藥用植物成分鑒定等領(lǐng)域，大大拓展了REIMS技術(shù)的應(yīng)用范圍。相信隨著REIMS采樣裝置的多樣化和精細(xì)化以及多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件的配套，該技術(shù)有望為更多領(lǐng)域研究提供新的解決方案。目前關(guān)于REIMS技術(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道中多為定性檢測(cè)，在定量或半定量檢測(cè)方面鮮見報(bào)道，如何采用REIMS技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)定量分析也是未來重點(diǎn)研究的方向之一。