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        苦瓜籽多肽K提取工藝優(yōu)化研究

        2021-02-26 03:13:18馮誠誠蘇健琚茜茜黃玉輝黃熊娟梁家作陳小鳳秦健劉杏連黃如葵
        食品研究與開發(fā) 2021年4期
        關鍵詞:瓜籽堿液農(nóng)科

        馮誠誠,蘇健,琚茜茜,黃玉輝,黃熊娟,梁家作,陳小鳳,秦健,劉杏連,黃如葵*

        (1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,廣西 南寧 530007;2.廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530200)

        苦瓜(Momordica charantia L.)主要分布在熱帶和溫帶地區(qū),我國南北方均有栽培[1],具有較高的營養(yǎng)價值和保健功效,是一種藥食同源的蔬菜[2]??喙虾涂喙献迅缓嚯?、多糖、皂苷、類黃酮等多種生物活性成分[3-7],具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、增強免疫力及預防肥胖等功效[8-10]。近年來,Ⅱ型糖尿病和營養(yǎng)性肥胖成為影響人類身體健康的主要慢性疾病之一[11]。但是改善血糖的藥物普遍具有副作用,探尋天然有效的改善胰島素抵抗藥物仍然是藥物研發(fā)中重要的方向[12-13]??喙献讯嚯哪苡行Ц纳埔葝u素抵抗狀態(tài),進一步減緩Ⅱ型糖尿病的發(fā)病進程,其中在類胰島素研究方面降糖多肽P和降糖多肽K備受關注[14-17]??喙献讯嚯腒的分子量為18 000 kDa,由18種氨基酸組成,性質(zhì)比較穩(wěn)定。經(jīng)過小鼠和臨床實驗發(fā)現(xiàn),降糖多肽K無需注射,口服就具有較好的降糖效果[18]。但是關于苦瓜多肽K分離純化的方法,以及對不同品種苦瓜籽的多肽K含量比較研究尚未見報道。因此,本研究以苦瓜籽為原料,采用堿提酸沉法結合單因素試驗優(yōu)化多肽K提取工藝條件,并用建立的方法篩選出多肽K含量高的苦瓜品種,為苦瓜降糖功能產(chǎn)品的開發(fā)提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        泰國山苦瓜籽、綠水果苦瓜籽、杜阮大頂苦瓜籽、大肉2號苦瓜籽、桂農(nóng)科9號苦瓜籽:廣西農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。5個苦瓜品種材料均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所里建科研基地。苦瓜田間種植常規(guī)管理,2017年3月播種,7月采收結束。

        蛋白裂解液(BC3720)、廣譜蛋白 Marker(5 kDa~245 kDa,PR1930)、蛋白酶抑制劑混合液(P6732):北京索萊寶科技有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳液(P0014B)、蛋白上樣緩沖液(P0015)、廣譜蛋白Marker(10 kDa~150 kDa,P0060M)、BeyoGelTMPlus PAGE預制膠(P0523S):碧云天生物技術有限公司;碳酸鈉(分析純):天津市北辰方正試劑廠;碳酸氫鈉(分析純):天津市致遠化學試劑有限公司);鹽酸(分析純)、甲醇(分析純)、丙酮(分析純)、氫氧化鈉(分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 儀器與設備

        電子天平(BSA224S):賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司;冷凍干燥機(Alpha 1-2 Ldplus):博然科儀有限公司;電泳儀(BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD):伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司;冷凍離心機(5810R):北京康高特科技有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 苦瓜籽脫脂處理

        將苦瓜籽在研缽中研磨成細粉,過40目篩,精密稱取1 g,置均質(zhì)器中,加入預冷(-20℃)的甲醇2 mL(含蛋白酶抑制劑20 μL),在冰上研磨20 min,用甲醇轉移至15 mL離心管中,在4℃,14 000 r/min離心5 min,棄去上清液,沉淀用10 mL預冷甲醇洗2次,再用預冷的丙酮-水(體積比3∶1,-20℃)溶液10 mL洗3次,在4℃,14 000 r/min離心5 min后,收集沉淀,揮發(fā)去大部分溶劑,再置冷凍干燥機中凍干,即得到脫脂后的苦瓜籽凍干粉末,稱重,冷藏備用。

        1.3.2 苦瓜籽總蛋白提取

        精密稱取脫脂后的苦瓜籽凍干粉末0.05 g,加入蛋白裂解液0.5 mL,冰上孵育25 min,期間渦旋振蕩5次,然后在4℃,14 000 r/min離心30 min,收集上清液即為苦瓜籽總蛋白液,冷藏備用。

        1.3.3 堿提酸沉法提取苦瓜多肽K

        精密稱取脫脂后的苦瓜籽凍干粉末0.5 g,加入10 mL 碳酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH 9.5),振搖后超聲10min,在50℃水浴上靜置1h,然后在4℃,10000r/min離心10 min,取上清液,用1 mol/L HCl調(diào)整pH值至3.0,靜置 30 min,4 ℃,10 000 r/min 離心 10 min,收集沉淀,加入2 mL碳酸鈉緩沖液(0.1 mol/L,pH 9.0)使其溶解,即獲得堿提酸沉的多肽K溶液。

        1.3.3.1 堿液pH值的優(yōu)化

        以桂農(nóng)科9號苦瓜籽為原料,固定料液比為1∶20(g/mL)、提取溫度為50℃,依次調(diào)節(jié)提取堿液的pH 值為 8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,浸提 60 min 后,用1 mol/L HCl調(diào)整pH值至3.0,以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)標準溶液(1mg/mL)作為蛋白質(zhì)定量的對照,計算苦瓜多肽K提取率。

        1.3.3.2 提取溫度的優(yōu)化

        以桂農(nóng)科9號苦瓜籽為原料,固定提取堿液的pH值為 9.5,料液比為 1 ∶20(g/mL),分別在溫度為 40、45、50、55、60℃條件下浸提60 min,計算苦瓜多肽K提取率。

        1.3.3.3 料液比的優(yōu)化

        以桂農(nóng)科9號苦瓜籽為原料,固定提取溫度為50℃,提取堿液的 pH 值為 9.5,分別以 1∶10、1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL)為料液比,浸提 60 min,計算苦瓜多肽K提取率。

        1.3.3.4 提取時間的優(yōu)化

        以桂農(nóng)科9號苦瓜籽為原料,固定料液比為1∶20(g/mL)、提取溫度為50℃,提取堿液的pH值為9.5,在 50 ℃的水浴中分別加熱 30、60、90、120 min,計算苦瓜多肽K提取率。

        1.3.3.5 蛋白酸沉pH值的優(yōu)化

        以桂農(nóng)科9號苦瓜籽為原料,固定料液比為1∶20(g/mL)、提取溫度為50℃,堿液pH值為9.5,在50℃的水浴中分別加熱60 min,用1 mol/L HCl順序調(diào)整pH 值至 7.0、6.0、5.0、4.0和 3.0,靜置 30 min,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,收集每個pH值下的沉淀,計算苦瓜多肽K提取率。

        1.3.4 苦瓜籽蛋白的電泳分析

        以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)分離蛋白,分離膠濃度為4%~20%,每個泳道蛋白質(zhì)上樣量約為50 μg,以廣譜蛋白Marker作為分子量大小的對照,以牛血清白蛋白(BSA)標準溶液(1 mg/mL)作為蛋白質(zhì)定量的對照,在110 V電壓下電泳90 min。電泳后用考馬斯亮藍G250染色液染色60 min,純水脫色16 h,直至背景清晰,拍照。蛋白質(zhì)電泳的結果采用分析軟件Image Lab 6.0進行分析。

        1.3.5 苦瓜籽多肽K提取率計算

        式中:CBSA為標準蛋白上樣濃度,μg/μL;ABSA為標準蛋白電泳分析條帶響應值;AK為多肽K電泳分析條帶響應值;n為樣品稀釋倍數(shù);L為樣品上樣量,μL;W為苦瓜籽粉末質(zhì)量,g。

        不同品種苦瓜籽多肽K含量計算方法同上公式。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用Excel和SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析,數(shù)據(jù)結果以±sD表示。

        2 結果與分析

        2.1 堿液pH值對苦瓜籽多肽K提取率的影響

        堿液pH值對苦瓜籽多肽K提取率的影響結果見圖1。

        圖1 堿液pH值對苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.1 Effect of alkaline solution pH on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds

        從圖1可以看出,在pH 8.0~9.5的堿性范圍內(nèi),多肽K提取率隨著pH值的提高呈上升趨勢,當pH值為9.5時,多肽K的提取率達到峰值,蛋白質(zhì)溶液達到飽和狀態(tài)。隨著pH值的繼續(xù)增加,多肽K提取率開始減小,原因可能是pH值大于9.5時,苦瓜籽蛋白變性嚴重,導致多肽K的損失增加。因而在此試驗條件下,多肽K提取的最適pH值為9.5。

        2.2 提取溫度對苦瓜籽多肽K提取率的影響

        提取溫度對苦瓜籽多肽K提取率的影響結果見圖2。

        圖2 提取溫度對苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds

        由圖2可以看出,溫度對苦瓜籽多肽K提取率影響較大。當提取溫度為40℃時,由于反應體系溫度較低,多肽K提取率也很低。當溫度從40℃上升到50℃時,多肽K提取率隨著溫度的增加逐漸增大,并且在50℃時提取率達到最大值,但隨著溫度繼續(xù)增加,其中部分蛋白質(zhì)變性,導致多肽K提取率略有下降。因此,多肽K提取的最適溫度為50℃。

        2.3 料液比對苦瓜籽多肽K提取率的影響

        料液比對苦瓜籽多肽K提取率的影響結果見圖3。

        圖3 料液比對多肽K提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd seeds

        從圖 3 可以看出,當料液比 1∶10(g/mL)~1∶20(g/mL)時,多肽K提取率隨著溶劑體積的增加而增大,且變化幅度較大。當料液比為1∶20(g/mL)時,多肽K提取率最高。之后隨著溶劑體積繼續(xù)增大多肽K提取率的變化幅度不大??紤]到加水量增加會導致多肽K分離時間大幅加長,所以選擇料液比為1∶20(g/mL)。

        2.4 提取時間對苦瓜籽多肽K提取率的影響

        提取時間對苦瓜籽多肽K提取率的影響結果見圖4。

        圖4 提取時間對苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd

        由圖4可知,苦瓜籽多肽K提取率隨提取時間延長呈先增大后減小的趨勢,當提取時間為60 min時,多肽K提取率達最大值。當提取時間超過60min,多肽K提取率逐漸降低,但變化幅度不大。因此,在此單因素試驗條件下多肽K的最佳提取時間為60 min。

        2.5 蛋白酸沉pH值對苦瓜籽多肽K提取率的影響

        蛋白酸沉pH值對苦瓜籽多肽K提取率的影響結果見圖5。

        圖5 酸沉pH值對苦瓜籽多肽K提取率的影響Fig.5 Effect of acid precipitation pH on polypeptide-K extraction ratio of bitter gourd

        由圖5可知,通過比較在不同pH值條件下的多肽K提取率,發(fā)現(xiàn)酸沉pH值對多肽K提取率影響不大,因此本試驗選擇將酸沉的pH值直接調(diào)整至3.0。

        2.6 不同品種苦瓜籽的多肽K含量

        苦瓜籽總蛋白電泳圖見圖6。不同品種苦瓜籽多肽K含量見表1??喙蠅A提酸沉法提取的蛋白電泳圖見圖7。

        圖6 苦瓜籽總蛋白電泳圖Fig.6 The total protein electrophoresis of bitter gourd seeds

        表1 不同品種苦瓜籽多肽K含量Table 1 The content of polypeptide-K in different varieties of bitter gourd seeds

        圖7 苦瓜籽堿提酸沉法提取的蛋白電泳圖Fig.7 Electrophoresis of protein extracted from bitter gourd seeds by alkali extraction-acid precipitation method

        由圖6可以看出,使用蛋白裂解液提取的總蛋白電泳條帶豐富,分子量分布在6 kDa~75 kDa之間,5個品種的蛋白質(zhì)條帶分布大致相同。其中4個苦瓜籽品種在18 kDa的位置均有清晰的條帶,而泰國山苦瓜籽18 kDa位置的條帶不明顯。經(jīng)與BSA標準蛋白比對和計算,桂農(nóng)科9號苦瓜籽的多肽K含量最高,為2.06 mg/g,多肽K含量最低的是泰國山苦瓜籽,僅為0.20 mg/g,前者為后者的10.30倍(表1)。經(jīng)堿提酸沉工藝優(yōu)化提取后,高分子量的蛋白質(zhì)被除去,電泳圖中高分子蛋白質(zhì)條帶數(shù)量與總蛋白提取法相比明顯減少,主要的條帶分布在35 kDa以下(圖7),說明堿提酸沉法可以用于苦瓜籽多肽K的初步純化。經(jīng)堿提酸沉工藝處理后,其中多肽K提取率最高的是桂農(nóng)科9號苦瓜籽,其次是綠水果苦瓜籽,泰國山苦瓜籽的多肽K提取率最低。

        3 結論

        本研究以5個品種的苦瓜籽為研究對象,通過蛋白裂解法對苦瓜籽總蛋白中的多肽K含量進行比較研究,發(fā)現(xiàn)不同品種的苦瓜籽多肽K含量有顯著差異,篩選出2個含量相對較高的品種,分別是桂農(nóng)科9號苦瓜籽和綠水果苦瓜籽,其中桂農(nóng)科9號苦瓜籽的多肽K含量最高,為2.06 mg/g。以桂農(nóng)科9號苦瓜籽為原料,通過料液比、堿液pH值、酸沉pH值、提取溫度、提取時間5個因素對堿提酸沉工藝進行優(yōu)化研究,獲得最佳工藝條件為料液比1∶20(g/mL)、堿液pH 9.5、提取時間60 min、提取溫度50℃,酸沉pH3.0。此工藝條件下,桂農(nóng)科9號苦瓜籽中多肽K提取率為0.18 mg/g。研究結果可為苦瓜籽精深加工和降糖多肽K為主要功能成分的產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

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