周春艷 鄭雪丹 楊德琴

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市高等教育口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶401147

鐵離子的動態(tài)平衡對維持有機(jī)體的正常功能起關(guān)鍵作用，越來越多的研究[1-6]發(fā)現(xiàn)鐵離子失衡在許多常見疾病中發(fā)揮重要作用，例如帕金森病、阿爾茲海默癥、缺血-再灌注損傷、動脈粥樣硬化、肺炎及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。因此，細(xì)胞內(nèi)精密的鐵離子調(diào)控機(jī)制對生物體極為重要。鐵蛋白是生物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)鐵離子濃度平衡的蛋白之一，參與多種生物過程。它由24 個亞基組成的一個內(nèi)徑為8 nm、外徑約為12 nm 的一個中空球體狀蛋白[7]，內(nèi)部形成礦化核約可以儲存4 500 個鐵原子[8]。組成鐵蛋白的亞基包括2 種不同類型的多肽鏈：重鏈H 和輕鏈L，分別由不同的基因fth 和ftl編碼[9]，2 種亞基具有不同功能，L 亞基有吸取鐵離子貯藏于鐵蛋白中的作用[10]，H亞基主要發(fā)揮鐵氧化酶作用[11]，將二價鐵離子氧化為可溶性三價鐵離子儲存于鐵蛋白中，可以減少亞鐵離子帶來的超氧化造成的細(xì)胞損傷。在不同的生物及器官內(nèi)，組成鐵蛋白的H和L亞基比例不同而發(fā)揮不同功能來維持生物體的鐵離子整體平衡[12-14]。

fth 基因的5’端非編碼區(qū)序列通常很長，包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)鐵響應(yīng)原件（iron responsive element，IRE），鐵響應(yīng)原件可以與胞質(zhì)中的鐵調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合[15]，從而調(diào)控鐵蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)一步影響細(xì)胞鐵離子濃度的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致鐵離子濃度失衡而損害機(jī)體健康。目前關(guān)于IRE 序列突變的研究[15-16]顯示，IRE 的突變會影響鐵蛋白mRNA 的翻譯效率，導(dǎo)致鐵蛋白重鏈亞基蛋白減少從而造成遺傳性鐵過載，但是關(guān)于fth 編碼基因本身的突變未見報道。

斑馬魚是分子生物學(xué)常用的模式動物之一，其產(chǎn)卵量大，體外受精，胚胎透明及具有終生替換咽齒等特性也使其成為牙齒發(fā)育與再生相關(guān)研究的良好模型[17]。斑馬魚咽齒的發(fā)育模式與哺乳動物具有極高的相似性[18]，早期上皮增厚形成牙板，后上皮凹陷包繞間充質(zhì)，硬組織礦化形成成熟的牙齒；且組織切片染色和電鏡結(jié)果顯示，斑馬魚咽齒的顯微結(jié)構(gòu)也與哺乳動物類似，由外部的類牙釉質(zhì)、類牙本質(zhì)和內(nèi)部空腔組成[19-20]。

有研究[21]報道，鐵蛋白基因在多種動物多種細(xì)胞中均有表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，首次發(fā)現(xiàn)編碼鐵蛋白重肽基因fth1b 在斑馬魚咽齒部位特異性表達(dá)，并利用規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9基因編輯法的獨(dú)特優(yōu)勢[22]，對該基因特異性敲除，在篩選得到的可穩(wěn)定遺傳突變體（mutant，MUT）中檢測發(fā)現(xiàn)，斑馬魚咽齒早期形成并無明顯缺陷，包括上皮增厚及形態(tài)形成過程均正常發(fā)生，而早期礦化過程受到一定程度的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚均來自于西南大學(xué)分子發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，按照國際動物管理委員會的規(guī)定在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下飼養(yǎng)與繁殖。實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚胚胎中加入0.003% 1-苯基-2-硫脲抑制黑色素生成，便于顯微鏡下觀察。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

rTaq DNA 聚合酶（Takara公司，日本），多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）（Sigma-Aldrich 公司，美國），無水甲醇、乙醇[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司]，Anti Dig-AP、顯色液（Roche 公司，德國），cas9 蛋白（NEB 公司，美國），實(shí)驗(yàn)設(shè)備主要包括Heraeus BK-600 立式恒溫胚胎培養(yǎng)箱、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀及水浴鍋（Eppendorf公司，德國），體視顯微鏡（Leica 公司，德國），共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss 公司，德國）。PCR 所用全部引物及DNA 測序均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3 整胚原位雜交

收集野生型（wild-type，WT）斑馬魚56、72、96、120 hpf [受精后小時（hours post fertilization，hpf）]胚胎，4%PFA 固定過夜后無水甲醇脫水并于-30 ℃儲存。按文獻(xiàn)[23-24]描述進(jìn)行原位雜交，檢測基因fth1b、dlx2b的表達(dá)情況：1）將胚胎依次于75%甲醇/25%磷酸鹽緩沖液含吐溫20（phosphate buffer solution/tween-20，PBT）、50%甲醇/50%PBT、25%甲醇/75%PBT、100%PBT 中漂洗5 min 復(fù)水后，加入含蛋白酶K 的PBT 緩沖液消化20 min，然后加入4%PFA 固定30 min，PBT 緩沖液漂洗3次，每次5 min，固定后胚胎進(jìn)入68.5 ℃水浴鍋預(yù)雜交3 h，加入探針雜交液，水浴鍋中過夜；2）回收探針雜交液，漂洗胚胎后加入封閉液室溫下封閉2 h，然后加入含抗地高辛抗體的二抗反應(yīng)液，4 ℃孵育過夜；3）回收二抗后漂洗胚胎，并將胚胎轉(zhuǎn)移至24 孔板中避光顯色，顯色充分后于體式顯微鏡下觀察拍照。

1.4 利用CRISPR/Cas9 基因編輯法特異性敲除fth1b基因

從Ensembl 數(shù)據(jù)庫中下載fth1b 基因序列，根據(jù)基因序列選定合適的基因敲除靶位點(diǎn)，并根據(jù)靶位點(diǎn)設(shè)計合成正反向引物，然后通過PCR 合成能與靶位點(diǎn)特異性結(jié)合的導(dǎo)向RNA（guide RNA，gRNA），其中正向引物序列為：5,-taatacgactcactatagggtgaggcagaacttccaccgttttagagctagaaatagca-3,；反向引物序列為：5,-aaaaaaagcaccgactcggtgccac-3,。將合成的gRNA 與cas9 蛋白顯微注射到單細(xì)胞WT胚胎（約300 枚）中，gRNA 可引導(dǎo)cas9 蛋白到靶位點(diǎn)處對基因fth1b 進(jìn)行特異性剪切使其編碼序列改變從而導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)功能缺失。

1.5 篩選MUT 及檢測其咽齒相關(guān)基因的表達(dá)情況

經(jīng)顯微注射后的胚胎飼養(yǎng)至性成熟后裂解魚鱗，測序檢測，篩選出MUT F0，F(xiàn)0 與WT 斑馬魚交配得F1，當(dāng)F1 生長至3 個月大小，裂解魚鱗，測序檢測，經(jīng)檢測確定的雜合MUT 與WT 斑馬魚交配得F2，性成熟后裂解魚鱗測序檢測，經(jīng)檢測確定得到的雜合MUT 自交得F3，性成熟后裂解魚鱗檢測，此時經(jīng)檢測確定得純合MUT，是能穩(wěn)定遺傳的MUT fth1b-/-。通過篩選得到穩(wěn)定遺傳的MUT 后，分別收集48、96 hpf 的MUT 胚胎及WT胚胎通過原位雜交檢測咽齒相關(guān)基因pitx2、dlx2b的表達(dá)情況。

1.6 檢測MUT咽齒礦化情況

通過共聚焦顯微鏡直接觀察及茜素紅染色的方法對MUT 發(fā)育過程中咽齒礦化情況進(jìn)行檢測。茜素紅染色：分別收集野生型與MUT 120 hpf 胚胎，4%PFA 4 ℃固定過夜后PBT緩沖液漂洗5 min，50%乙醇常溫下脫水0.5 h后加入1 mL PBT和20 μL 0.05%茜素紅染色液過夜染色，然后漂白液室溫下漂白20 min，洗去漂白液，于50%甘油/0.25%氫氧化鉀中保存及圖片采集。共聚焦顯微鏡：在2.5 倍體式顯微鏡下用鑷子剝離120 hpf 野生型及MUT 胚胎的心臟等組織，充分暴露咽齒，瓊脂糖凝膠固定后于共聚焦顯微鏡下直接觀察并采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 基因dlx2b、fth1b 在斑馬魚咽齒中的特異性表達(dá)情況

對dlx2b、fth1b 的表達(dá)情況檢測結(jié)果顯示：在56 hpf 時，咽齒部位無dlx2b 表達(dá)，在72～120 hpf各時期，dlx2b 特異性表達(dá)于斑馬魚咽齒（圖1），同時，在56 hpf時，咽齒部位無fth1b表達(dá)，在72～120 hpf，fth1b 在斑馬魚咽齒表達(dá)且在全身其他部位無表達(dá)（圖2），這表明fth1b 基因與目前公認(rèn)斑馬魚咽齒標(biāo)記基因dlx2b 表達(dá)情況一致，特異性表達(dá)于斑馬魚咽齒，提示此基因可能在斑馬魚咽齒的發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

2.2 fth1b基因敲除MUT構(gòu)建結(jié)果

經(jīng)cas9 蛋白注射后，fth1b 基因被成功突變（圖3）。如圖3 所示，基因敲除導(dǎo)致在cas9 靶位點(diǎn)處1個堿基缺失，造成移碼突變，從而導(dǎo)致編碼序列改變，提前終止，編碼氨基酸由177 個減少為16個。

2.3 fth1b-/-中斑馬魚咽齒相關(guān)基因pitx2 及dlx2b 表達(dá)情況

在fth1b-/-MUT中，對pitx2、dlx2b的表達(dá)情況檢測結(jié)果顯示，48 hpf時pitx2的表達(dá)與WT斑馬魚并無較大差別，均在咽齒上皮處有較強(qiáng)表達(dá)（圖4）；在96 hpf時，dlx2b的表達(dá)范圍、強(qiáng)度與WT斑馬魚無較大差別（圖4）。此結(jié)果提示，在fth1b-/-MUT中，斑馬魚咽齒的起始及上皮增厚形態(tài)形成等過程并未受到影響。

圖2 56～120 hpf時基因fth1b在斑馬魚咽齒的表達(dá)情況Fig 2 The expression of gene fth1b in 56-120 hpf zebrafish embryos

圖3 WT斑馬魚及fth1b MUT的基因序列（A）和蛋白編碼序列（B）Fig 3 The gene sequence（A）and protein coding sequence（B）of WT zebrafish and mutant fth1b

2.4 fth1b-/-斑馬魚咽齒礦化檢測結(jié)果

通過茜素紅染色結(jié)果可以觀察到，在120 hpf時，WT 斑馬魚腹側(cè)第四位置第一顆咽齒4V1已完全礦化，腹側(cè)第三、五位置第一顆咽齒3V1及5V1處于礦化初期，僅牙尖部可見少量礦化信號，而在MUT 中，僅可見4V1礦化，3V1及5V1處未見礦化信號（圖5）；共聚焦顯微鏡下觀察，MUT 斑馬魚中，咽齒的數(shù)量及形態(tài)均與野生型斑馬魚相同，礦化稍弱（圖5）。因此，筆者認(rèn)為在fth1b-/-MUT中，牙齒的早期發(fā)育及形態(tài)形成均正常，而早期礦化受到影響，即fth1b 基因在斑馬魚咽齒的礦化過程中發(fā)揮作用。

3 討論

大量研究已證實(shí)鐵離子濃度平衡對機(jī)體保持健康極為重要，其對血液系統(tǒng)的影響會造成缺鐵性貧血等疾病，并且過量鐵離子能通過氧化應(yīng)激作用導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡，而鐵蛋白作為鐵離子濃度調(diào)節(jié)的重要蛋白，能夠作為抗氧化劑對細(xì)胞起保護(hù)作用，并且有研究報道鐵蛋白是一種有前途的藥物載體，可用于腫瘤的靶向治療。盡管對鐵蛋白功能作用的研究日益增多，但其在牙齒發(fā)育中的作用及影響尚未見報道。

圖4 基因pitx2、dlx2b在WT與MUT斑馬魚咽齒的表達(dá)情況Fig 4 The expression of gene pitx2 and dlx2b in WT and MUT embryos

圖5 120 hpf時斑馬魚咽齒數(shù)量、形態(tài)及礦化情況Fig 5 The number，shape and mineralization of zebrafish teeth at 120 hpf

早期報道表明，多個基因可以特異性標(biāo)記斑馬魚咽齒，其中pitx2、dlx2b 是較為常用的標(biāo)記基因，pitx2 表達(dá)于咽齒上皮，是斑馬魚咽齒最早表達(dá)的基因，標(biāo)志著斑馬魚咽齒起始發(fā)育；dlx2b 表達(dá)于間充質(zhì)與上皮，是神經(jīng)棘細(xì)胞來源。在本實(shí)驗(yàn)中，本課題組首次發(fā)現(xiàn)鐵蛋白重肽基因fth1b 與dlx2b 在斑馬魚的表達(dá)模式相同，特異性表達(dá)于咽齒。fth1b 基因特異性表達(dá)于斑馬魚咽齒部位，極有可能對斑馬魚咽齒的發(fā)育過程發(fā)揮作用，因此課題組首次嘗試使用CRISPR/cas9基因敲除技術(shù)特異性敲除該基因，在可穩(wěn)定遺傳fth1b-/-突變體中，檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型斑馬魚相比，突變體斑馬魚咽齒pitx2和dlx2b的表達(dá)均無較大差異，但茜素紅染色及共聚焦顯微鏡觀察顯示咽齒礦化減弱，意味著突變體斑馬魚咽齒起始與形態(tài)形成過程正常而早期礦化受到影響。目前對牙齒發(fā)育的大量研究集中于牙齒的發(fā)生、形態(tài)形成及干細(xì)胞探索等方面，對于牙齒礦化的研究相對較少，但是在生活中，礦化缺陷是一種危害極大的牙齒疾病，例如遺傳性乳光牙本質(zhì)及釉質(zhì)發(fā)育不全，牙齒極易磨損暴露牙髓，從而導(dǎo)致炎癥發(fā)生，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)基因fth1b 在斑馬魚咽齒表達(dá)且對牙齒礦化有作用，為以后更深入探索牙齒礦化及相關(guān)疾病提供了又一證據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。