司雨婷 宋金花 方珍 韓曉哲 蔣少云

1.天津醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙周科，天津300070；2.北京大學深圳醫(yī)院口腔醫(yī)學中心牙周科，深圳518036；3.美國哈佛大學牙學院Forsyth研究所，美國劍橋02146

牙周炎是一種慢性感染性疾病，免疫炎癥機制起了重要作用，其中包括淋巴細胞和細胞因子[1-2]。淋巴細胞既可以保護機體，也可以引起牙周組織的破壞[2-4]。microRNAs（miRs）約含有22個堿基，能通過結合靶基因的非轉錄區(qū)下調靶基因的表達，從而在炎癥免疫中扮演關鍵的角色[5-7]。已有研究[8-9]表明miRs 在牙周炎中起著重要的作用。研究發(fā)現miR-128能調節(jié)牙周致病菌——牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）刺激下巨噬細胞的炎癥反應[10]，miR-24 作為負調節(jié)因子參與被P. gingivalis脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活的巨噬細胞極化[11]。miR-146a缺乏導致T濾泡輔助細胞和生發(fā)中心B細胞的聚集，增強生發(fā)中心反應[12]。而且P. gingivalis能激活淋巴細胞引起牙周炎癥[13-14]。前期研究[15-17]發(fā)現miR-146a 能抑制人牙齦成纖維細胞、牙周膜成纖維細胞和B 細胞分泌因子，如白細胞介素（interleukin，IL）1β、IL-6 和腫瘤壞死因子α，從而參與牙周炎的調節(jié)。雖然淋巴細胞在牙周炎免疫調節(jié)過程中起著重要的作用[2]，但miR-146a如何調節(jié)淋巴細胞尚不知。本研究目的是探索miR-146a對P. gingivalisLPS 刺激下淋巴細胞中細胞因子分泌的作用，為進一步闡明miR-146a 對牙周炎癥的調節(jié)作用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

C57BL/6小鼠（8～10周，美國Jackson實驗室）；改良伊格爾培養(yǎng)液（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、左旋谷氨酸和兩性霉素B、ACK 紅細胞裂解液（Gibco 公司，美國），P.gingivalisLPS（Strain ATCC 33277，InvivoGen 公司，美國），miR-146a 模擬物、miR-146a 抑制劑或陰性RNA 對照、HiPerFect 轉染試劑（Qiagen 公司，美國），PureLink?RNA Mini Kit 和SuperScript Ⅱ逆轉錄酶（Invitrogen 公司，美國），LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster（Roche 公司，德國），小鼠IL-1β、IL-6、IL-10 免疫酶聯(lián)反應（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）MAXTM試劑盒（Biolegend 公司，美國），小鼠Trance 和骨保護素（osteoprotectin，OPG）ELISA DuoSet試劑盒（R&D system公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠淋巴細胞的提取和培養(yǎng) 根據美國Forsyth研究所的研究動物使用指南，處死C57BL/6小鼠（動物倫理編號：17-002），進行解剖。收集脾臟，在培養(yǎng)液（10%胎牛血清，100 units·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素，2 mmol·L-1左旋谷氨酸，0.25 μg·mL-1兩性霉素B）中輕柔研磨。1 500 r·min-1離心5 min 收集細胞。用1 mL ACK 紅細胞裂解液處理，去除紅細胞。離心后懸浮于培養(yǎng)液，以每孔1×106個接種于96 孔板中。根據對細胞采用的刺激物（1 μg·mL-1P. gingivalisLPS、miR-146a 模擬物、miR-146a 抑制劑或陰性RNA 對照）不同，將實驗分為6 組，分別為P. gingivalisLPS 未刺激組、P. gingivalisLPS 刺激組、P. gingivalisLPS/miR-146a 模擬物組、P. gingivalisLPS/模擬物陰性RNA 對 照 組、P. gingivalisLPS/miR-146a 抑 制 劑組、P.gingivalisLPS/抑制劑陰性RNA 對照組。處理細胞24 h 后收集培養(yǎng)的上清液和淋巴細胞進行檢測。

1.2.2 細胞轉染 以每孔1×106細胞接種于96孔板，37 ℃和5%CO2培養(yǎng)2 h。miR-146a 模擬物、抑制劑和陰性RNA 對照（終濃度10 nmol·L-1）與HiPerFect 轉染試劑混合，室溫中放置10 min，形成轉染復合物。加入細胞，轉染24 h。隨后用1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激，24 h 后檢測細胞因子的表達。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR） 用Pure-Link? RNA Mini Kit 提取總RNAs。SuperScript Ⅱ逆轉錄試劑盒和LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster 進行逆轉錄和qRT-PCR。IL-1β、IL-6、IL-10、OPG、細胞核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator NF-κB ligand，RANKL）、甘油乙酰三磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 和U6 small nuclear RNA 引物見表1[17-18]。GAPDH 和U6 分 別作為mRNA 和miRs內參。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.2.4 ELISA 反應 使用小鼠ELISA 試劑盒分析IL-1β、IL-6、IL-10、RNAKL、OPG 的分泌。收集的上清液加入抗體包被的96 孔板中孵育后用含0.1% Tween 的PBS 沖洗。與一抗和二抗反應后，加入底物，37 ℃孵育15～30 min。加入終止液后用微板讀數儀（Bio-tek 公司，美國）在450 nm 波長檢測光密度（optical density，OD）值。

1.3 統(tǒng)計分析

所有的實驗至少重復2 次。數據以平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行實驗數據分析。兩組間數據用雙側Student’st檢驗分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 P. gingivalis LPS 刺激淋巴細胞分泌炎癥細胞因子

與P.gingivalisLPS未刺激組相比較，1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激后炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 和RANKL 的mRNA 水 平 升 高（P＜0.05），OPG 的mRNA 水平明顯下降（表2）。ELISA 結果顯示：1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激后炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10 和RANKL 的分泌明顯升高（P＜0.05），而OPG 的分泌無明顯改變（P＞0.05）（表3）。這些數據提示P.gingivalisLPS 能影響淋巴細胞分泌細胞因子。

表2 P.gingivalis LPS對淋巴細胞中細胞因子mRNA水平的影響Tab 2 The effects of P. gingivalis LPS on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes

表3 P.gingivalis LPS對淋巴細胞分泌細胞因子的作用Tab 3 The effects of P. gingivalis LPS on the secretion of cytokines in lymphocytes

2.2 P. gingivalis LPS 刺激對淋巴細胞中miR-146a表達的影響

1 μg·mL-1P. gingivalisLPS 刺激后用qRT-PCR檢測miR-146a 的表達情況。與非LPS 刺激組（0.95±0.19）相比較，1 μg·mL-1P.gingivalisLPS刺激后，miR-146a 的表達明顯升高（1.76±0.73）（t=2.778，P=0.019 5），說明miR-146a可能參與P.gingivalisLPS刺激后淋巴細胞的炎癥反應。

2.3 miR-146a 模擬物對P. gingivalis LPS 刺激下淋巴細胞分泌細胞因子的調節(jié)作用

miR-146a模擬物轉染細胞后用1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激，24 h 后檢測IL-1β、IL-6、IL-10、OPG和RANKL的表達。與P.gingivalisLPS/模擬物陰性RNA 對照組（1.81±0.56）相比，miR-146a 模擬物能明顯升高miR-146a（10.65±0.82）的水平（t=15.42，P=0.000 1），miR-146a升高明顯抑制IL-1β、IL-6和RANKL mRNA 的表達和分泌，但是促進IL-10 和OPG 的mRNA 表 達和 分 泌（P＜0.05）（表4、5）。

2.4 miR-146a 抑制物對P. gingivalis LPS 刺激下淋巴細胞分泌細胞因子的調節(jié)作用

miR-146a抑制物轉染細胞后用1 μg·mL-1P.gingivalisLPS 刺激，檢測IL-1β、IL-6、IL-10、OPG和RANKL 的表達。與P. gingivalisLPS/抑制劑陰性RNA 對照組（1.76±0.38）相比，miR-146a 抑制物能明顯抑制細胞內miR-146a（0.36±0.09）的水平（t=6.209，P=0.003 4），miR-146a 水平降低后明顯促進IL-1β、IL-6 和RANKL mRNA 表達和分泌，但是抑制IL-10 和OPG 的mRNA 表達和分泌（P＜0.05）（表6、7）。

表4 miR-146a 模擬物對P. gingivalis LPS 刺激的淋巴細胞中細胞因子mRNA水平的影響Tab 4 The effects of miR-146a mimics on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表5 miR-146a 模擬物對P. gingivalis LPS 刺激的淋巴細胞分泌細胞因子的作用Tab 5 The effects of miR-146a mimics on the secretion of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表6 miR-146a 抑制物對P. gingivalis LPS 刺激的淋巴細胞中細胞因子mRNA水平的影響Tab 6 The effects of miR-146a inhibitor on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

表7 miR-146a抑制物對P.gingivalis LPS刺激的淋巴細胞分泌細胞因子的作用Tab 7 The effects of miR-146a inhibitor on the mRNA levels of cytokines in lymphocytes stimulated by P.gingivalis LPS

3 討論

淋巴細胞在牙周炎的發(fā)病過程中起著重要作用[19]，參與牙周炎中牙齦炎癥和牙槽骨的喪失[4]。miR-146已經被認為通過調節(jié)炎性因子的分泌在炎癥中起著保護性作用[15-17]。

IL-1β 參與牙周炎的炎癥反應。齦溝液和唾液中IL-1β 水平升高與牙周炎的進展密切相關[20-21]。IL-1β 具有雙向功能：低濃度時（生理健康水平）促進成骨作用，但是高濃度時能抑制牙周膜干細胞的成骨過程，后者是修復牙槽骨的主要細胞[22]。同樣，IL-1β 能促進巨噬細胞向M1 型極化，后者負責骨組織的吸收[23]。本研究發(fā)現：P. gingivalisLPS能促進淋巴細胞中IL-1β表達。IL-1β升高能阻礙牙周膜干細胞的成骨過程，加速骨吸收，不利于骨組織的修復和再生。miR-146a 升高能下降IL-1β，抑制miR-146a 能促進淋巴細胞中IL-1β 的水平，說明miR-146a通過調節(jié)IL-1β在淋巴細胞介導的骨修復和骨吸收中起著保護性的作用。

作為主要炎性因子之一的IL-6 在牙周炎中起著重要的作用。有研究顯示：齦溝液中IL-6 濃度與牙周炎的臨床指標呈正相關性[21,24]，而且參與局部B細胞反應[21]。P.gingivalisLPS能促進牙齦成纖維細胞和牙周膜成纖維細胞中IL-6 的分泌[15-16]。本研究證實P. gingivalisLPS 能明顯提高淋巴細胞中IL-6 的水平，miR-146a 能降低淋巴細胞中IL-6 的產生，但抑制miR-146a 能促進淋巴細胞中IL-6 的水平，與其他的研究[17]相一致，這些結果說明miR-146a 通過降低淋巴細胞分泌IL-6，減少IL-6促進的牙周炎癥。

IL-10 作為抗炎細胞因子，通過抑制破骨細胞引起的骨吸收，促進成骨細胞介導的骨形成來維持骨量[24-25]。T 細胞、B 細胞和其他的牙周細胞能分泌IL-10[10,26-27]。Zhang等[24]發(fā)現：慢性牙周炎和侵襲性牙周炎患者的齦溝中IL-10 水平明顯升高。雖然研究[10]顯示：抑制miR-146a 不改變人牙齦成纖維細胞分泌IL-10，而且抗IL-10 抗體能保護P.gingivalisLPS 注射的小鼠形成膿腫[27]。P. gingivalisLPS 能促進B 細胞分泌IL-10，miR-146a 抑制B細胞分泌IL-10，miR-146a 抑制物能促進B 細胞分泌IL-10[17]。但是，本研究發(fā)現miR-146a 模擬物能促進淋巴細胞分泌IL-10，且其抑制物阻止淋巴細胞分泌IL-10。從小鼠脾臟獲得的淋巴細胞是T 細胞和B 細胞的混合細胞，細胞之間的交互作用對細胞因子的分泌起著重要的調節(jié)作用，從而導致miR-146a 對淋巴細胞產生的作用與單純B 細胞不一致。

RANKL和OPG是調節(jié)骨吸收和骨形成的重要因子[28]。RANKL 升高促進骨吸收；反之，OPG 升高促進骨形成。淋巴細胞中T 細胞和B 細胞是RANKL 和OPG 重要的分泌細胞。本研究發(fā)現：P.gingivalisLPS 能抑制淋巴細胞分泌OPG，促進淋巴細胞分泌RANKL。但是，miR-146a能促進淋巴細胞OPG分泌，抑制淋巴細胞分泌RANKL，說明即使在炎癥環(huán)境中miR-146a 也能促進骨形成，抑制骨吸收。而且以往的研究[29]顯示：miR-146a 能促進P. gingivalisLPS 刺激下人牙周膜成纖維細胞的成骨分化，進一步說明了miR-146a 促進成骨的效應。

綜上所述，miR-146a 能調節(jié)P. gingivalisLPS刺激下的淋巴細胞分泌與牙周炎癥相關的炎性細胞因子和骨調節(jié)因子，從而調控骨改建過程，為牙周骨組織再生的方法提供新的思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。