李小龍 余 梅 段 勁

臨床上最常見(jiàn)的牙體病理性改變是齲，對(duì)于齲齒的治療，最常見(jiàn)的方法是樹(shù)脂充填修復(fù)［1］。在牙本質(zhì)齲外層的是齲感染牙本質(zhì)，內(nèi)層的是齲影響牙本質(zhì)［2］。在牙科微創(chuàng)理念中，由于齲影響牙本質(zhì)具有再礦化能力，因此建議去腐時(shí)保留齲影響牙本質(zhì)，作為粘接的基底［3］。在牙本質(zhì)齲發(fā)生的過(guò)程中，齲影響牙本質(zhì)由于脫礦，形成了更高的孔隙率，同時(shí)脫礦牙本質(zhì)中的膠原纖維由于酸的作用，改變了其正常的結(jié)構(gòu)。因此，齲影響牙本質(zhì)與正常牙本質(zhì)在結(jié)構(gòu)及成分含量上存在本質(zhì)上的不同［4］。

在齲發(fā)生的過(guò)程中，由于齲影響牙本質(zhì)發(fā)生了脫礦，導(dǎo)致齲影響牙本質(zhì)的硬度較正常牙本質(zhì)低，因此粘接后，粘接劑對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度也較正常牙本質(zhì)低［5］。另外，齲影響牙本質(zhì)的病理過(guò)程伴隨著再礦化，沉積的礦物質(zhì)會(huì)堵塞牙本質(zhì)小管，降低了粘接劑中樹(shù)脂單體對(duì)齲影響牙本質(zhì)小管的滲透能力，粘接后形成的樹(shù)脂突長(zhǎng)度及微鎖結(jié)強(qiáng)度也會(huì)下降［6，7］。因此提高樹(shù)脂粘接劑對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度在臨床上有著重要的意義。

在自酸蝕粘接劑的粘接過(guò)程中，酸蝕與樹(shù)脂單體滲透的過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，因此玷污層并沒(méi)有被去除，樹(shù)脂單體和改良的玷污層最終形成混合層［8］。由于樹(shù)脂滲透深度與酸蝕深度并不匹配，因此，在混合層與脫礦牙本質(zhì)之間形成了一層裸露的膠原纖維，即微滲漏。微滲漏中的膠原纖維容易被牙本質(zhì)內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及內(nèi)源性水分所酶解和水解。由于齲影響牙本質(zhì)存在脫礦現(xiàn)象，粘接后形成的混合層也較正常牙本質(zhì)厚，因此在齲影響牙本質(zhì)中形成的混合層更加容易被酶解及水解［9］。如何抑制酶解及水解作用，增加粘接耐久性，也是各國(guó)研究者對(duì)粘接劑研究的重點(diǎn)。

EGCG是一種綠茶提取物，是綠茶多酚的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化作用，MMPs 酶抑制作用等［10］。研究表明EGCG可以有效抑制體內(nèi)MMPs的活性，在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著顯著效果［11］。同時(shí)，EGCG也是一種膠原蛋白交聯(lián)劑，可以提高膠原蛋白的交聯(lián)度，降低水解作用［12］。因此，作為一種天然的MMPs抑制劑，EGCG是否能提高SBU對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接性能是本實(shí)驗(yàn)研究的內(nèi)容。

1.材料與方法

1.1 材料Single Bond Universal（3MESPE，美國(guó)）；P60（3MESPE，美國(guó)）；EGCG（Sigma，美國(guó)）；中齲離體牙；微拉伸儀（Bisco，美國(guó)）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國(guó)）；慢速線性切割機(jī)（Struers，丹麥）；齲指示劑（Voco，德國(guó)）；光固化燈（3MESPE，美國(guó)）；體視顯微鏡（Leica，德國(guó)）；掃描電鏡（電子株式會(huì)社，日本）。

1.2 方法

1.2.1 配置試劑 配置含有終濃度為100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml EGCG 的SBU 粘接劑，以不含EGCG的SBU粘接劑為對(duì)照組。

1.2.2 粘接強(qiáng)度測(cè)試 在齲指示劑下制備齲影響牙本質(zhì)。將制備好的離體牙隨機(jī)分組，按照分組進(jìn)行粘接，上方堆塑樹(shù)脂。用慢速線性切割機(jī)在流動(dòng)水下沿牙體長(zhǎng)軸進(jìn)行切割，制備微拉伸試件（0.9mm×0.9mm）。在體視顯微鏡下將有粘接缺陷試件排除。將試件浸泡于超純水中24h。在微拉伸儀下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算微拉伸強(qiáng)度。

1.2.3 斷裂界面觀察 將所有微拉伸后斷裂試件在掃描電鏡下觀察斷裂界面的顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 微滲漏檢測(cè) 收集人中齲離體牙，按照實(shí)驗(yàn)2方法進(jìn)行牙齒處理及粘接，用慢速線性切割機(jī)在流動(dòng)水下沿牙體長(zhǎng)軸進(jìn)行切割，制備成約1mm厚度牙本質(zhì)試件。將試件浸泡于含有1%羅丹明-B-異硫氰酸酯的50%乙醇溶液中，染色24h，流動(dòng)水下清洗，去除未染色的多余染料。在激光共聚焦顯微鏡下觀察微滲漏。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 EGCG 對(duì)SBU 粘接強(qiáng)度的影響 實(shí)驗(yàn)組的微拉伸強(qiáng)度顯示于表1中。如圖所示，EGCG添加后SBU對(duì)齲影響牙本質(zhì)粘接的微拉伸強(qiáng)度明顯提高（P＜0.0001，F(xiàn)=17.11），隨著添加EGCG濃度的升高，SBU 對(duì)齲影響牙本質(zhì)粘接強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P=0.0141，F(xiàn)=5.013）。但是EGCG 200μg/ml組與EGCG 300μg/ml組之間的粘接強(qiáng)度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.8698）。

表1 添加不同濃度EGCG后SBU對(duì)齲影響牙本質(zhì)微拉伸強(qiáng)度（MPa，)

表1 添加不同濃度EGCG后SBU對(duì)齲影響牙本質(zhì)微拉伸強(qiáng)度（MPa，)

注：與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（a，P＜0.0001；與EGCG 100μg/ml組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（b，P＜0.05）

2.2 斷裂界面微觀形態(tài)觀察 斷裂界面觀察的冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡圖片顯示于圖1中。如圖所示，在對(duì)照組中，斷裂界面位于混合層下層，在圖中可以觀察到空虛的牙本質(zhì)小管，樹(shù)脂突從牙本質(zhì)小管內(nèi)完全脫離，同時(shí)可以觀察到齲影響牙本質(zhì)小管中沉積物，牙本質(zhì)小管并不均一。在EGCG 100μg/ml組中可以觀察到斷裂界面位于混合層中，圖片中顯示有空虛的牙本質(zhì)小管，同時(shí)也有粘接劑界面斷裂，部分樹(shù)脂突從于牙本質(zhì)小管內(nèi)脫離。在EGCG 200μg/ml及EGCG 300μg/ml組中，斷裂界面位于混合層上層或者樹(shù)脂層中，可見(jiàn)斷裂的粘接劑或者樹(shù)脂，樹(shù)脂突基本存留與牙本質(zhì)小管內(nèi)，樹(shù)脂突與牙本質(zhì)小管的嵌合程度較高，粘接強(qiáng)度也較高。

圖1 微拉伸斷裂界面掃描電鏡圖片。A、對(duì)照組；B、EGCG 100 μg/ml組；C、EGCG 200 μg/ml組;D、EGCG 300 μg/ml組。圖中D為牙本質(zhì)，R為樹(shù)脂，H為混合層，白色箭頭顯示空虛牙本質(zhì)小管，黑色箭頭顯示有樹(shù)脂突牙本質(zhì)小管。

2.3 粘接微滲漏結(jié)果 粘接界面激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示于圖2中。如圖所示，齲影響牙本質(zhì)粘接界面并不均勻一致。與對(duì)照組相比較，添加了EGCG后粘接界面微滲漏明顯減少，隨著EGCG濃度的升高，粘接界面微滲漏持續(xù)減少。但添加200μg/ml及300μg/ml濃度EGCG間沒(méi)有明顯區(qū)別。

圖2 微滲漏激光共聚焦圖片。A、對(duì)照組；B、EGCG 100 μg/ml組；C、EGCG 200 μg/ml組;D、EGCG 300 μg/ml組。圖中D為牙本質(zhì)，R為樹(shù)脂，白色箭頭顯示微滲漏。

3.討論

齲齒是口腔臨床上最常見(jiàn)的病理性改變，齲影響牙本質(zhì)是口腔粘接修復(fù)最常見(jiàn)的粘接基底。在齲齒發(fā)生的過(guò)程中，齲影響牙本質(zhì)發(fā)生部分脫礦，孔隙率增高，因此，在齲影響牙本質(zhì)中形成的混合層較正常牙本質(zhì)厚，更加容易被牙本質(zhì)內(nèi)激活的MMPs酶解，降低粘接耐久性［4,13］。另外，齲影響牙本質(zhì)發(fā)生再礦化現(xiàn)象，抗酸性礦物沉積于牙本質(zhì)小管中，同時(shí)伴隨著脫礦牙本質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)的改變，不利于樹(shù)脂粘接劑的酸蝕，降低粘接劑樹(shù)脂單體對(duì)脫礦牙本質(zhì)的滲透［7］。上述原因影響了樹(shù)脂粘接劑對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接性能，降低粘接強(qiáng)度［6］。同時(shí)，牙本質(zhì)內(nèi)固有水分也較容易水解粘接后的膠原纖維層，影響粘接耐久性［14］。因此，如何提高樹(shù)脂粘接劑對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度及粘接耐久性是口腔臨床上的一大挑戰(zhàn)［9］。

為了提高樹(shù)脂粘接劑對(duì)正常牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度，在國(guó)外研究中有研究者將EGCG預(yù)處理后進(jìn)行全酸蝕或者自酸蝕粘接劑的粘接，發(fā)現(xiàn)可以提高粘接劑的粘接強(qiáng)度［15］。但是沒(méi)有研究將EGCG直接混入第八代粘接劑中，研究EGCG是否能提升第八代粘接劑SBU的粘接強(qiáng)度及EGCG對(duì)SBU的理化性能是否會(huì)有影響。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加EGCG后，SBU對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度明顯提升。EGCG作為一種天然交聯(lián)劑，可通過(guò)氫鍵或者疏水鍵與脫礦牙本質(zhì)膠原纖維結(jié)合，形成不溶性復(fù)合物，維持膠原纖維的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提高酸蝕后樹(shù)脂單體對(duì)牙本質(zhì)膠原纖維及小管的滲透能力，形成更加穩(wěn)定的牙本質(zhì)-樹(shù)脂微鎖結(jié)，以及形成更加穩(wěn)定的牙本質(zhì)小管-樹(shù)脂突復(fù)合體，從而提升樹(shù)脂粘接劑對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度［14］。

粘接界面的降解是由兩種機(jī)制引起，一種是混合層中樹(shù)脂粘接劑的水解作用，另外一種是混合層中裸露膠原的酶解作用。內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶，特別是MMP-2/MMP-9在齲發(fā)生或者酸蝕的過(guò)程中被激活，從而產(chǎn)生溶膠原活性［16］。為了克服酶降解的問(wèn)題，合成MMPs抑制劑，如氯己定或天然類型，如原花青素，已被提出用于處理齲影響牙本質(zhì)或者正常牙本質(zhì)，延緩混合層的降解，保持混合層的穩(wěn)定性，增加粘接耐久性［17，18］。EGCG作為一種天然的MMPs抑制劑，在抗腫瘤活性及抗氧化作用中被廣泛研究［19］。EGCG在體內(nèi)有較強(qiáng)的MMP-2/MMP-9抑制活性。因此，國(guó)內(nèi)外研究者也正在研究EGCG作為一種MMPs抑制劑是否能提高粘接劑混合層的抗酶解作用，穩(wěn)定混合層的結(jié)構(gòu)，提高粘接耐久性。在Santiago的研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG預(yù)處理可以提高樹(shù)脂粘接劑對(duì)正常牙本質(zhì)的粘接耐久性［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SBU添加EGCG后可明顯降低形成混合層的微滲漏，有利于抑制牙本質(zhì)內(nèi)源性的酶解作用及水解作用，保持脫礦牙本質(zhì)膠原纖維的穩(wěn)定性。EGCG的酶抑制作用機(jī)制仍不完全明確，有研究提出MMPs的激活依賴于鋅離子的，多酚類物質(zhì)有較強(qiáng)的金屬離子螯合作用，因此，EGCG有可能是通過(guò)與鋅離子的螯合作用，抑制MMPs活性［21］。在本研究中，作者猜想EGCG也有可能是通過(guò)與鋅離子的螯合作用，抑制MMPs活性。但是EGCG是否能提高SBU對(duì)牙本質(zhì)的粘接耐久性仍需后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

4.結(jié)論

EGCG作為一種基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑和天然交聯(lián)劑，可以明顯提升齲影響牙本質(zhì)中脫礦牙本質(zhì)膠原纖維的交聯(lián)度，降低牙本質(zhì)內(nèi)源性MMPs酶和余留水分子對(duì)裸露膠原纖維的酶解和水解作用，明顯提高了SBU對(duì)齲影響牙本質(zhì)的粘接強(qiáng)度，減少微滲漏，提升了第八代粘接劑SBU的粘接性能，對(duì)臨床有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。