梁寶萍，王 勇，趙紅星，李 艷，姜 俊，段 瑩

(駐馬店市蔬菜遺傳育種工程技術(shù)研究中心，駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院，河南 駐馬店 463000)

茄子(SolanummelongenaL.)是重要的蔬菜作物，其生長周期短，經(jīng)濟效益良好，且營養(yǎng)價值豐富，具有清熱解暑、散血通腸、延緩衰老、降脂降壓、防治胃癌等保健功能，在全世界廣泛栽培[1]。茄子具有顯著的雜種優(yōu)勢，利用雜種優(yōu)勢提高茄子的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義，但傳統(tǒng)的育種手段時間長、效率低等缺點已不能滿足新的育種目標。生物技術(shù)對農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出了重大的貢獻，其中單倍體育種能縮短育種年限，提高育種效率，在植物的育種和基礎(chǔ)研究中有著重要應用價值[2]。獲得單倍體的方法較多，最常用的方法之一是茄子的花藥培養(yǎng)。在茄子花藥誘導愈傷組織的過程中，愈傷組織可以從花藥頂端、花藥側(cè)面以及花藥基部3個不同部位誘導[3]。茄子花藥可經(jīng)由胚狀體誘導和愈傷組織誘導兩種途徑再生，但后者是獲得再生植株的主要方式[4]。

愈傷分化不僅綠苗率低，而且容易玻璃化、發(fā)育畸形、生長緩慢,而且植物組織存在很強的物種依賴性和基因型特異性[5]。在茄子花藥培養(yǎng)的相關(guān)研究中，關(guān)于采花藥時期、預處理、誘導培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑、染色的倍性等方面均有詳細的敘述，但是愈傷分化成苗的研究報道較少。愈傷成苗不定芽分化成苗率低，可改善培養(yǎng)條件及激素的種類以提高成苗率。茄子花藥培養(yǎng)效果不佳，愈傷組織誘導率不高，綠芽分化率低，體細胞干擾嚴重，單倍體出現(xiàn)的頻率較低等問題，仍然有待克服。本研究對茄子花藥外植體進行愈傷組織誘導和綠芽分化研究，建立茄子單倍體育種技術(shù)體系，篩選具備分化不定芽潛能基因型，選擇分化培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)分化時間，提高綠苗率，縮短茄子新品種材料選育時間。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試茄子(SolanummelongenaL.)品種為西安綠茄、綠翠二號、黑仙子、豫藝2號，均由駐馬店市農(nóng)業(yè)科學院園藝所蔬菜課題組提供。2018年3月育苗，4月底定植于試驗地塑料大棚。定期去掉植株上開放的花和果，使植株始終處于開花狀態(tài)，其他同常規(guī)田間管理。

1.2 方 法

1.2.1材料采集及預處理

參照張玉苗[6]的方法，分別采集不同品種茄子花冠長與花蕾萼基部差值在2 mm以內(nèi)的花蕾，將采集的花蕾低溫(4 ℃)預處理3 d后備用。

1.2.2外植體愈傷及分化誘導培養(yǎng)

將低溫(4 ℃)預處理3 d后的花蕾取出，在流水下沖洗10 min，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞消毒6 min，之后10 min之內(nèi)用無菌水沖洗4次。用無菌濾紙吸干花蕾表面水分，剝出花藥接種在誘導培養(yǎng)基上(MS+0.2 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1KT+2%蔗糖+6 g瓊脂)，高溫(36 ℃)暗培養(yǎng)6 d后，再25 ℃暗培養(yǎng)30 d，愈傷接到F1培養(yǎng)基(MS+0.05 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA+1%蔗糖+6 g瓊脂，pH=5.8)和F2培養(yǎng)基上(MS+0.05 NAA+1 mg·L-1ZT+1%蔗糖+6 g瓊脂，pH=5.8)分化，選擇西安綠茄、綠翠二號、黑仙子、豫藝2號適合的誘導激素，每個品種接種80枚花藥。在適宜的分化培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)3、4、5、6周后統(tǒng)計愈傷組織率和分化率，每個品種接種48枚花藥，選擇最宜轉(zhuǎn)分化時間。

接種后觀察污染情況，及時清除污染。30 d后，每隔7 d調(diào)查一次愈傷組織數(shù)、分化數(shù)、綠苗數(shù)、畸形數(shù)。

愈傷組織率(%)=(產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/接入的花藥數(shù))×100%(去除污染的)；

分化率(%)=(產(chǎn)生綠色原基的愈傷組織數(shù)/接入愈傷組織數(shù))×100%(去除污染的)；

綠苗率(%)=(綠苗數(shù)/接愈傷組織數(shù))×100%；

畸形率(%)=(畸形芽/綠苗數(shù))×100%(去除污染的)。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導培養(yǎng)基對不同花藥出愈形態(tài)的影響

茄子花藥在誘導培養(yǎng)基上，經(jīng)過高溫處理之后，整個花藥逐漸膨大，之后花藥壁隨著培養(yǎng)時間變成褐色，15 d左右出現(xiàn)愈傷組織。由圖1可見，愈傷組織有4種不同的狀態(tài)：第一種為黃白色松散型(圖1 A)；第二種為黃白色緊密型(圖1 B)；第三種淺綠色松散型(圖1 C)；第四種淺綠色緊密型(圖1 D)。

2.2 誘導培養(yǎng)基對不同花藥分化的影響

不同的茄子品種在誘導培養(yǎng)基上形成的愈傷類型有所差別(表1)，翠綠二號，黑仙子分化黃白色松散型愈傷，分化芽點早，形成極少不定芽，生長速度較慢，后期容易玻璃化；西安綠茄，豫藝2號主要分化黃白色緊密型愈傷，這種類型的愈傷分化不定芽較多，生長緩慢，分化芽點的時間稍晚，愈傷生長緩慢，豫藝2號和西安綠茄分別分化少量綠色松散型愈傷和綠色緊密型愈傷，生長慢，第一個芽點分化時間最晚。

表1 愈傷類型分布Table 1 Distribution of callus types

2.3 不同轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)時間對出愈率和分化率的影響

接種培養(yǎng)30 d后，在F1和F2兩種分化培養(yǎng)基上分化(表2)，在F1上豫藝2號分化率最高，為235%，西安綠茄分化率次之，達106.66%；在F2上豫藝2號分化率高，達120%，西安綠茄次之為67%。結(jié)果表明，豫藝2號和西安綠茄更適合在F1培養(yǎng)基上分化，細胞分類素6-BA的效果要優(yōu)于ZT。而綠翠二號和黑仙子的花藥在F2上的分化率優(yōu)于在F1上，但是畸形率100%，說明這2個品種分化也較適合激素6-BA。

表2 不同分化培養(yǎng)基對茄子花藥培養(yǎng)的影響Table 2 Effects of different differentiation media on anther culture of eggplant

分化后培養(yǎng)一段時間，不定芽有不同程度的畸形致使后期綠苗生長緩慢，甚至死亡。豫藝2號在F1上畸形率高達74%，在F2上畸形率64%，但是總體上綠苗率高于F2分化培養(yǎng)基。西安綠茄在F1上的畸形率低于在F2上的。在F1和F2上黑仙子分化的芽全部畸形，翠綠二號不定芽在F1上全部分化成畸形(表3)。結(jié)果表明，不同品種的茄子花藥分化時對不同種類的激素敏感度不同，形成的畸形率較高。

表3 不同轉(zhuǎn)分化時間對分化率的影響Table 3 Effects of different transdifferentiation time on differentiation rate

在誘導培養(yǎng)基上誘導后，在F1分化培養(yǎng)基(MS+0.05 mg·L-1NAA+1 mg·L-16-BA+1%蔗糖+6 g瓊脂)上培養(yǎng)3周、4周、5周、6周。翠綠二號、西安綠茄、豫藝2號在培養(yǎng)第5周轉(zhuǎn)分化時分化率最高，分別為20%、107%、78%，而黑仙子在第4周轉(zhuǎn)分；翠綠二號在第4、5、6周轉(zhuǎn)分化都有分化，在第3周時分化率為0，西安綠茄、豫藝2號在第3、4、5、6周轉(zhuǎn)分化都能分化成芽，黑仙子在其他時間轉(zhuǎn)分化，分化率為0。

3 討論與結(jié)論

供試的4個茄子品種均能誘導出愈傷組織，愈傷組織也都能分化出不定芽，茄子花藥愈傷組織的綠芽分化受基因型、愈傷組織類型、分化培養(yǎng)基中植物激素類型、轉(zhuǎn)分化時間的影響，在芥菜[7]、甘藍[8]等作物中也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。證明基因型對花藥再生的影響極為復雜，涉及到基因表達、激素代謝等多個生理生化反應[9]。松散型愈傷和緊密型愈傷組織都能誘導出綠芽，但是產(chǎn)生的綠芽生理狀態(tài)不同，緊密型愈傷的分化成苗率較高，這與王蒂[10]的研究結(jié)果一致。本研究中松散型和緊密型愈傷組織均能分化出綠苗，但是松散型愈傷分化的綠苗畸形率高，容易生長緩慢，玻璃化。產(chǎn)生的原因可能是生長環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境對愈傷組織的形成有一定的影響,愈傷組織誘導培養(yǎng)基中激素種類對愈傷組織分化有一定的影響[11]。不同茄子繼代的時間不同，分化率有所不同，這可能是調(diào)控小孢子發(fā)育過程中關(guān)鍵基因啟動信號通路時間不同。

外源激素具有傳遞遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等發(fā)育信號的作用，而外源激素的效果與外植體以及愈傷組織本身內(nèi)源激素的種類有密切的關(guān)系[12]。鮑生有等[13]在茄子花藥愈傷再生植株研究中用蘇茄5號在NAA和6-BA的激素組合獲得了良好的效果，本研究結(jié)果與之相一致。茄子不同品種對分化激素種類不同，姜懸云等[14]使用ZT和NAA激素組合進行不定芽分化，獲得較高的不定芽誘導率。結(jié)果表明，6-BA和ZT兩種激素都能對茄子花藥誘導的愈傷組織繼代產(chǎn)生不定芽，對某些基因型茄子愈傷和不定芽具有良好的誘導效果。一定濃度的6-BA和ZT為芽再生所必須，但高濃度的6-BA和ZT容易造成畸形芽，不同材料對6-BA和ZT的敏感性不同，這與不同材料的內(nèi)源激素有關(guān)[14]。激素對不同基因型茄子花藥培養(yǎng)的影響有待進一步研究，以篩選出畸形率低，分化率高的激素和濃度。