楊小紅，侯 娜

(1.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴陽 550005；2.貴州省核桃研究所，貴陽 550005)

核桃為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)木本油料植物，其經(jīng)濟及營養(yǎng)價值很高。貴州核桃主要集中分布于畢節(jié)市、威寧縣、六盤水市、黔西南州等地，除海拔較低的干熱河谷地區(qū)外，其余各地均有分布。由于貴州省地理氣候多樣，在長期的自然雜交和實生繁殖及不同立地條件影響下，形成種類繁多的生態(tài)型和農(nóng)家品種[1-2]。

SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)，即相關(guān)序列擴增多態(tài)性，是一種基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)[3-4,11]，已應(yīng)用于西藏光核桃和新疆野核桃的遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、核心種質(zhì)構(gòu)建，以及核桃雌花開花期相關(guān)分析[5-9]，但尚未見SRAP標(biāo)記應(yīng)用于貴州核桃農(nóng)家品種的報道。本研究對貴州核桃農(nóng)家品種進(jìn)行了遺傳多樣性的SRAP分析，以期為資源的收集、分類和鑒定及育種工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

試驗材料采自貴州省六盤水市、普安縣、貴陽市、興義市、赫章縣、畢節(jié)市、沿河縣生長良好、無病蟲害的樣株，隨機取樣，以幼嫩葉片作為試驗材料，共收集了168份核桃葉片樣品。

1.1 主要試劑、引物及儀器

SRAP引物選擇參考Li等[3]的方法，由蘇州泓迅生物科技有限公司合成；CWBIO北京生物技術(shù)有限公司提供dNTP Mixture、10×PCR Buffer、25 mmol·L-1MgCl2、TapDNA聚合酶；天根生化科技服務(wù)有限公司提供100 bp DNA marker[10-12]。

供試儀器為Long Gene A 200型PCR儀(朗基公司)、DYY-12型電泳儀(北京六一公司)等。

1.2 DNA提取

采集新鮮嫩葉，裝入放有硅膠的封口袋中，做好標(biāo)記，待干燥好后放到-20 ℃冰箱中保存待用[10-11]。基因組DNA的提取參照任耀忠的方法；測定DNA的濃度和純度(用核酸蛋白分析儀)后，加入超純水使DNA樣品濃度稀釋到10 ng·μL-1，保存在-20 ℃冰箱備用[10-11]。

1.3 篩選SRAP-PCR引物組合

該反應(yīng)在Long Gene A 200型PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為：CWBIO北京生物技術(shù)有限公司提供的10 μL 2×TaqMasterMix，總體積20 μL，100 μmol·L-1正反向引物各1.0 μL，7 μL的雙蒸水和1 μL的模板DNA。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；前5個循環(huán)為94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min；隨后進(jìn)行的35個循環(huán)為94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃[13-15]。

擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠(凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為0.5×TBE)電泳檢測，室溫電泳2 h，穩(wěn)壓250 V，顯色方法為銀染法[13,15]。用4份樣品編號為10、33、50、160(分別采自盤州市、普安縣、貴陽市花溪區(qū)、修文縣)的DNA作為模板對132對SRAP引物組合篩選多態(tài)性引物，后續(xù)的試驗選用多態(tài)性好的引物[13]。

1.4 處理數(shù)據(jù)

使用清晰可辨且重復(fù)的SRAP擴增條帶，建立數(shù)據(jù)矩陣，無譜帶計為0，有譜帶計為1。計算多態(tài)性引物的多態(tài)性條帶與總擴增條帶比率。用NTSYS-pc2.10 e軟件進(jìn)行個體聚類分析，構(gòu)建聚類圖；使用Popgen 32軟件計算群體的Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、多態(tài)性位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選與擴增SRAP-PCR引物

通過篩選SRAP引物，有19對引物組合能夠擴增出可重復(fù)且清晰的條帶(表1)，條帶多數(shù)集中在50～1 000 bp間，且條帶清晰，故截選50～1 000 bp間的條帶進(jìn)行分析比較[11,13]。

表1 所用SRAP引物序列Table 1 SRAP primer sequences

利用Quantity One軟件進(jìn)行條帶統(tǒng)計，分析過程中，去除lane背景時統(tǒng)一將rolling disk size設(shè)置為5，detect band時，統(tǒng)一將Noise Filter設(shè)置為10。Report Options選擇Mol.Wt、Average Trace、Peak Density。將結(jié)果轉(zhuǎn)入Excel并轉(zhuǎn)化為0,1矩陣。

19對引物組合共擴增出309條條帶，其中多態(tài)性條帶281條，占總條帶的90.94%，表明樣本種質(zhì)具有豐富的DNA序列多態(tài)性。

2.2 基于SRAP結(jié)果的遺傳多樣性分析

2.2.1Shannon’s多樣性指數(shù)和Nei’s基因多樣度分析

應(yīng)用POPgene 32軟件計算實驗樣本的有效等位基因數(shù)位點數(shù)(Ne)，Nei’S基因多樣性(H)，Shannon’S信息指數(shù)(I)等參數(shù)估算計算整體和居群內(nèi)的遺傳多樣性指數(shù)(表2)。

表2 SRAP標(biāo)記估算遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters estimation estimated by SRAP markers

分析表2可以發(fā)現(xiàn)，各種源的多態(tài)位點百分率為20.71%～92.56%；6個種源中，以興義種源的遺傳多樣性最豐富(PPB=92.56%，Na=1.925 6，Ne=1.344 2，H=0.219 7，I=0.349 6)，其次是貴陽市、盤州市、普安縣、威寧縣、沿河縣。平均水平的遺傳等位基因數(shù)(Na)是2.000 0，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.358 8，Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.356 4，Nei’s基因多樣度(H)為0.225 6。

2.2.2親緣關(guān)系聚類分析

所采集的樣品包括串核桃、烏仁泡核桃、細(xì)香泡核桃、珍珠泡核桃、光滑(泡)核桃、麻殼泡核桃、鐵夾泡核桃、夾綿泡核桃等農(nóng)家品種[16]，應(yīng)用NTsys 2.10 e軟件得聚類分析樹狀圖(圖1)，由圖1可以看出，相似系數(shù)0.62處，所有核桃樣品聚類2個類群[13]；相似系數(shù)0.72處，所有樣品聚類10個類群。表明這些農(nóng)家品種具有親緣關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

一個居群生存、發(fā)展和進(jìn)化的基礎(chǔ)是遺傳多樣性，它包括生物所攜帶遺傳信息的總和[13,17]。遺傳多樣性分析顯示，興義市的遺傳多樣性最豐富。產(chǎn)生遺傳多樣性變化的原因復(fù)雜多樣，受遺傳漂變、自然選擇、生殖方式、基因流等因素影響，其本質(zhì)原因是物種等位基因數(shù)目或頻率的變化，還包括地理隔離、環(huán)境變化及人為干擾等[13]。來自興義市的樣本覆蓋范圍較廣，試驗所采樣本數(shù)量最大，種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)寬于其他各區(qū)，自然遺傳多樣性水平偏高[13]。另外，由于各種源地種質(zhì)的重合度高，遺傳相似性水平較高。由于貴州核桃農(nóng)家品種眾多，所采集的樣本有限，未能充分代表其多樣性和復(fù)雜性，因此還需要進(jìn)一步收集樣本，全面評估貴州核桃農(nóng)家品種的遺傳多樣性，為貴州核桃農(nóng)家品種種質(zhì)資源的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。