王亞娟 宮偉 黃珊

(1.保定市婦幼保健院麻醉科，河北 保定 071000；2.保定市第一醫(yī)院麻醉科，河北 保定 071000)

卵巢癌是影響女性生命健康的婦科腫瘤之首，手術是其主要治療方法[1-2]。舒芬太尼是一種強效的阿片類鎮(zhèn)痛藥，鎮(zhèn)痛作用強，作用時間長，不良反應少，常用于全身麻醉及術后鎮(zhèn)痛等[3-4]。近年來研究報道，麻醉藥具有抑癌作用，如舒芬太尼可抑制人肺腺癌A549細胞增殖并促進其凋亡[5]，還可以使胃癌SGC-7901細胞的活力下降，促進胃癌細胞凋亡[6]。然而舒芬太尼對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響及機制尚不清楚。研究表明長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)參與癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，lncRNA可作為腫瘤早期診斷、治療和判斷預后的潛在靶向標記物[7-8]。研究報道長基因間非編碼RNA 668(Long intergenic non-coding RNA 668，LINC00668)的表達水平與喉鱗狀細胞癌患者病理分化程度、T分期、臨床分期和宮頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，敲低LINC00668可以抑制喉鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[9]。新魚腥草酸鈉通過LINC00668/miR-147a/slug軸抑制非小細胞肺癌細胞的轉(zhuǎn)移[10]。但LINC00668對卵巢癌細胞是否有影響以及是否受舒芬太尼影響還尚未可知。本實驗旨在研究舒芬太尼對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制是否與調(diào)控LINC00668有關，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 A2780細胞購自上海澤葉生物科技有限公司；枸櫞酸舒芬太尼注射液(國藥準字H20054172)購自宜昌人福藥業(yè)股份有限公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢純度生物科技有限公司；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自美國Progema公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、蛋白提取試劑盒、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京Solarbio公司；Thermo FC酶標儀購自美國Thermo公司；FACSCanto II流式細胞儀購自美國 Bio-Rad公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞處理與分組 A2780細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞，分別給予終濃度為25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的舒芬太尼處理A2780細胞，分別記為實驗1、2、3組，正常培養(yǎng)的細胞作為對照組；將LINC00668小干擾RNA陰性對照(si-NC)、LINC00668小干擾RNA(si-LINC00668)分別轉(zhuǎn)染至A2780細胞中，記為si-NC組、si-LINC00668組；將LINC00668過表達質(zhì)粒陰性對照(pcDNA3.1)、LINC00668過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-LINC00668)轉(zhuǎn)染至A2780細胞中，同時用100 ng/mL的舒芬太尼處理，記為實驗3組+pcDNA3.1組、實驗3組+pcDNA3.1-LINC00668組。

1.3 流式細胞儀檢測細胞周期 各組細胞培養(yǎng)24h后收集細胞，并制備單細胞懸液，加入3 mL預冷的70%乙醇固定，用P緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A(RNase A)于37℃水浴30 min，加入碘化啶(PI)，避光30 min，上機檢測，重復3次。用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件對細胞周期進行檢測分析。

1.4 CCK-8檢測細胞存活率 選擇各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的細胞，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測各組細胞490 nm波長處的吸光度值(OD)。細胞增殖活力(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.5 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測Ki67、pro-caspase-3、clv-caspase-3蛋白表達 各組細胞培養(yǎng)24 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，再分別加入一抗(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育90 min，TBST洗滌，用ECL發(fā)光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統(tǒng)成像，用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.6 實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測LINC00668表達水平 各組細胞培養(yǎng)24 h，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；60℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。LINC00668以GAPDH為內(nèi)參，LINC00668上游引物序列：5′-GCGCTTTTGGAAGC AGTAAG-3′，下游引物序列：5′-TCCGAGCTCAGA CAGTGATG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTG CCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTC CACGACGTACTCAGCG-3′。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取轉(zhuǎn)染24 h后生長狀態(tài)良好的細胞，吸棄上清液，PBS漂洗細胞2次，吸棄PBS液，加1～2 mL胰酶消化細胞使之脫壁，靜置5～8 min，輕搖使之形成均勻細胞懸液，結(jié)合緩沖液終止消化，分別加Annexin V-FITC和PI各5 μL，輕搖混勻，再加入結(jié)合緩沖液350 μL，混勻，常溫避光孵育15 min，流式細胞儀檢測。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)SymbolqB@標準差表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 舒芬太尼對A2780增殖的影響 與對照組相比，舒芬太尼實驗2、3組G0期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2期細胞所占比例無顯著變化(P>0.05)；細胞存活率顯著降低，Ki67表達水平顯著降低(P<0.05)；而舒芬太尼實驗1組數(shù)據(jù)均無顯著變化，見圖1、表1。

圖1 Ki67蛋白的表達

表1 舒芬太尼對A2780增殖的影響

2.2 舒芬太尼對A2780凋亡及LINC00668表達的影響 與對照組相比，舒芬太尼實驗2、3組LINC00668表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，pro-caspase-3表達水平顯著降低，clv-caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05)；而舒芬太尼實驗1組均無顯著變化，見圖2、表2。

表2 舒芬太尼對A2780凋亡的影響

圖2 舒芬太尼對A2780凋亡及caspase-3蛋白表達的影響

2.3 抑制LINC00668對A2780增殖、凋亡的影響 與si-NC組相比，si-LINC00668組G0期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2期細胞所占比例無顯著變化(P>0.05)；細胞存活率顯著降低，Ki67表達水平顯著降低(P<0.05)；LINC00668表達水平顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，pro-caspase-3表達水平顯著降低，clv-caspase-3表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表3、表4。

圖3 抑制LINC00668對A2780凋亡及Ki67、caspase-3蛋白表達的影響

表3 抑制LINC00668對A2780增殖的影響

表4 抑制LINC00668對A2780凋亡的影響

2.4 過表達LINC00668能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對A2780增殖的影響 與實驗3組+pcDNA3.1組相比，實驗3組+pcDNA3.1-LINC00668組G0期細胞所占比例顯著降低，S期細胞所占比例顯著升高(P<0.05)，G2期細胞所占比例無顯著變化(P>0.05)；細胞存活率顯著升高，Ki67表達水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表5。

表5 過表達LINC00668能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對A2780增殖的影響

圖4 Ki67蛋白的表達

2.5 過表達LINC00668能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對A2780凋亡的影響 與實驗3組+pcDNA3.1組相比，實驗3組+pcDNA3.1-LINC00668組LINC00668表達水平顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，pro-caspase-3表達水平顯著升高，clv-caspase-3表達水平顯著降低(P<0.05)，見圖5、表6。

圖5 過表達LINC00668能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對A2780凋亡及caspase-3蛋白表達的影響

表6 過表達LINC00668能逆轉(zhuǎn)舒芬太尼對A2780凋亡的影響

3 討論

研究表明，部分麻醉藥具有抗腫瘤的作用[11]。舒芬太尼濃度≥5ng/mL時，可劑量依賴性抑制胃癌SGC-7901細胞的活力[12]；濃度>0.5ng/mL時可抑制食管鱗癌細胞的增殖，促進癌細胞的凋亡[13]。舒芬太尼還能通過改變肝癌細胞的細胞周期，促進細胞凋亡，抑制Hep3B細胞的活性[14]，也可通過上調(diào)Caspase-3的表達，促進大鼠肝癌瘤細胞凋亡[15]。本實驗用25 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的舒芬太尼處理的卵巢癌A2780細胞，研究其對卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果顯示，50 ng/mL、100 ng/mL舒芬太尼處理的A2780細胞中G0期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低，G1期細胞所占比例無顯著變化；且細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Ki67、pro-caspase-3表達水平顯著降低，clv-caspase-3表達水平顯著升高；Ki67是細胞增殖核抗原，研究表明抑制Ki67表達可抑制人卵巢癌OVCAR3細胞的增殖、并降低遷移及侵襲能力[16]。caspase-3介導的蛋白酶級聯(lián)反應是細胞凋亡發(fā)生的重要途徑之一，當外界信號刺激細胞凋亡時，caspase-3前體pro-caspase-3是細胞凋亡級聯(lián)反應的關鍵執(zhí)行者，其活化為clv-caspase-3，進而激活下游因子，促進細胞凋亡[17-18]。說明舒芬太尼可阻滯A2780細胞周期，抑制A2780細胞增殖、促進細胞凋亡；其可能與阻滯細胞周期和調(diào)節(jié)細胞凋亡相關蛋白表達有關。

研究報道LINC00668在乳腺癌中高表達，與乳腺癌患者的預后呈負相關，LINC00668可通過抑制細胞凋亡和加速細胞周期來促進乳腺癌的發(fā)展[19]。LINC00668的高表達水平與晚期TNM分期，組織學分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關；敲低LINC00668可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，遷移和侵襲，并促進細胞凋亡[20]，還可抑制結(jié)腸直腸癌細胞增殖和遷移潛能并誘導細胞凋亡[21]。以上結(jié)果均表明LINC00668參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，且其在腫瘤中可能起促癌作用。本實驗將LINC00668抑制表達載體轉(zhuǎn)染至2780細胞中，結(jié)果顯示，G0期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低，G1期細胞所占比例無顯著變化；細胞存活率顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，Ki67、pro-caspase-3表達水平顯著降低，clv-caspase-3表達水平顯著升高。說明抑制LINC00668表達可抑制卵巢癌A2780細胞增殖、促進細胞凋亡。還有研究報道，麥冬素B通過LINC00668/miR-432-5p/皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)軸抑制人肺腺癌細胞A549的轉(zhuǎn)移[22]。本實驗結(jié)果顯示，50 ng/mL、100 ng/mL舒芬太尼處理的A2780細胞中LINC00668表達水平顯著降低；且過表達LINC00668逆轉(zhuǎn)了舒芬太尼對A2780增殖、凋亡的影響。說明舒芬太尼可能通過LINC00668影響卵巢癌A2780細胞增殖、凋亡。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，舒芬太尼可能通過下調(diào)LINC0 0668的表達抑制卵巢癌細胞增殖，促進細胞凋亡。