加秀鳳 謝紀(jì)文 朱 銳△

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，武漢 430022 2湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065

肝纖維化是繼發(fā)于各種原因所致慢性肝損傷的共有病理改變，此時肝臟內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡被破壞，表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，并引起細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積[1-2]。如不進(jìn)行積極有效的治療干預(yù)，肝纖維化將進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[3]。盡管有研究證實肝纖維化的可逆性，目前仍缺乏確切有效的藥物阻止或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)展。鑒于肝硬化的難治性及肝癌的兇險性，尋找和研發(fā)延緩、阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物成為當(dāng)前研究的熱點。雖然去除病因在肝纖維化治療中具有重要作用，然而僅僅去除病因并不能阻止纖維化進(jìn)展，更不能完全代替抗纖維化治療[4]。

本課題組前期研究及有關(guān)文獻(xiàn)資料均顯示RAS經(jīng)典的ACE-AngⅡ-AT1R通路活化能促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程[5-6]。而有研究發(fā)現(xiàn)RAS中存在經(jīng)典通路以外的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)介導(dǎo)的ACE2-Ang(1-7)-Mas受體軸，其主要通過ACE2將AngⅡ降解而生成Ang(1-7)，而Ang(1-7)已知在體內(nèi)具有與AngⅡ相互拮抗的生物學(xué)效應(yīng)[7]。故以ACE2為干預(yù)靶點，增強ACE2-Ang(1-7)-Mas通路在RAS中的作用，抑制ACE-AngⅡ-AT1R通路的作用，恢復(fù)或重建RAS的自穩(wěn)平衡成為肝纖維化防治的新亮點。

“肝主藏血”的生理特性決定了病理狀態(tài)下易致肝血瘀阻，故“從瘀論治”是中醫(yī)治療肝纖維化的關(guān)鍵[8-9]。下瘀血湯是《金匱要略》中的經(jīng)典方劑，后世將該方變通運用于肝纖維化的治療，每獲良效[10-11]。然而，下瘀血湯治療肝纖維化的作用機制尚不明確。鑒于RAS在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，本研究以四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)肝纖維化的大鼠模型，探討經(jīng)方下瘀血湯是否通過恢復(fù)或重建RAS的自穩(wěn)平衡抑制肝纖維化，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar雄性大鼠27只，體重249～274 g，購自湖北省疾病預(yù)防與控制中心實驗動物中心，飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)，環(huán)境溫度20～24℃，濕度40%～70%，12 h光照循環(huán)，自由飲食。

1.2 藥物與試劑

下瘀血湯中藥顆粒購自華潤三九藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號：1201001S)，按照原方(大黃10 g，桃仁10 g，土鱉蟲6 g)比例溶解于大鼠日常飲用水中以灌胃治療，最終藥物濃度為320 mg/mL。CCL4分析純購自Sigma Chemical公司；抗AngⅡ抗體(sc-20718)購自美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司；抗ACE抗體(ab11734)、抗TGF-β1抗體(ab92486)、抗ACE2抗體(ab108252)、抗AT1R抗體(ab124505)均購自英國Abcam生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒(D9108A)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR036A)、PCR試劑盒(DRR420A)均購自中國大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；Western-blot試劑盒、BCA試劑盒、蛋白裂解液、免疫組化試劑盒購自谷歌生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

電子天平及高速低溫臺式離心機(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、RCR擴增儀(StepOneTMThermocycler，美國)、逆轉(zhuǎn)錄PCR儀(Mastergycle，德國)、可調(diào)式微量加樣器(Eppendorf，德國)、常規(guī)透射電子顯微鏡(FEI Tecnai G2 12型)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及動物分組

將27只SPF級雄性Wistar大鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、去除病因組、下瘀血湯組、氯沙坦鉀組，除正常組3只外，其余每組6只。除正常組外，各實驗組大鼠背部皮下注射2.5 mL/kg 40%CCL4橄欖油混懸液造模，每周2次，共8周。每周稱重1次，根據(jù)大鼠體重調(diào)整CCL4的用量。造模4周后，停止給去除病因組注射CCL4混懸液，而其他實驗組于繼續(xù)造模的同時分別給予相應(yīng)藥物(10 mL·kg-1·d-1)灌胃干預(yù)，每周干預(yù)5天后休息2天。

于第8周干預(yù)結(jié)束后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔，取肝臟組織分別以4%多聚甲醛固定以備HE染色、Masson三色膠原染色及免疫組織化學(xué)染色檢測；每組隨機選1例肝組織標(biāo)本以2.5%戊二醛固定，以備肝臟超微結(jié)構(gòu)觀察；取新鮮肝組織標(biāo)本，放置于-80℃冰箱保存，以待RT-PCR檢測AngⅡ、AT1R、TGF-β1、ACE和ACE2的基因表達(dá)；各引物序列來源于Gene Bank，PCR引物由中國大連Takara生物工程技術(shù)有限公司提供，具體見表1。Western-blot檢測AngⅡ、AT1R、TGF-β1、ACE和ACE2的蛋白表達(dá)。

表1 PCR引物序列及擴增片段

1.4.2 檢測方法與主要步驟

HE染色：將組織切片經(jīng)脫蠟、蘇木素液染色沖洗、脫水、透明并烤干后，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化并拍照。

Masson三色膠原染色：將切片脫蠟、Masson復(fù)合染色液染色、浸洗，然后苯胺藍(lán)染色，最后經(jīng)脫水、透明、封片烤干后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

超微病理學(xué)觀察：組織取材后經(jīng)鋨酸固定、梯度脫水、包埋、聚合，切片染色后，在透射電子顯微鏡下觀察，拍照記錄。

免疫組織化學(xué)：組織切片經(jīng)常規(guī)脫臘、封閉，室溫孵育，加一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木紫復(fù)染、脫水、透明、封片后，于光鏡下觀察拍照。

RT-PCR檢測：將肝組織經(jīng)勻漿、離心、沉淀后，行RNA的濃度和純度測定，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、擴增反應(yīng)后導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

Western-blot檢測：提取肝組織勻漿蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及雜交后行蛋白檢測及分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色可見：正常組(圖1A)肝組織內(nèi)肝小葉結(jié)構(gòu)正常、清晰，肝細(xì)胞索排列正常，即由中央靜脈向四周呈放射狀排列。其他組肝細(xì)胞排列紊亂，還可見不同程度脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤，且圖1中B～E病變程度依次加重，纖維組織增生增多，纖維間隔粗大，肝細(xì)胞變性壞死增多加重，肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸被假小葉替代。下瘀血湯組(圖1C)肝細(xì)胞脂肪變性比氯沙坦鉀組(圖1D)程度輕，肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤較少，膽管擴張不明顯且膽管內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落不明顯。模型組(圖1E)可見匯管區(qū)和中央靜脈區(qū)肝細(xì)胞大面積脂肪變性和片狀壞死，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，纖維間隔粗大，正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，大膽管擴張變形，小膽管增生，中央靜脈區(qū)可見少量膽汁淤積。見圖1。

A：正常組；B：去除病因組；C：下瘀血湯組；D：氯沙坦鉀組；E：模型組。

2.2 Masson三色膠原染色結(jié)果

Masson染色可見：正常組(圖2A)肝組織內(nèi)無膠原纖維增生，其他組均可見不同程度膠原纖維形成，且圖2中B～E逐漸加重。去除病因組(圖2B)僅在匯管區(qū)有極少量膠原纖維形成，肝小葉間未見纖維組織增生，但并未見假小葉形成，下瘀血湯組(圖2C)可見中央靜脈和匯管區(qū)纖維組織增生，小葉間靜脈、動脈及膽管受壓程度比氯沙坦鉀組(圖2D)輕，模型組(圖2E)可見肝細(xì)胞彌漫性變性、壞死，匯管區(qū)可見大量膠原纖維增生，增生的膠原纖維形成纖維分隔，重新分割、包繞肝組織而形成假小葉。見圖2。

A：正常組；B：去除病因組；C：下瘀血湯組；D：氯沙坦鉀組；E：模型組。

2.3 電鏡超微病理學(xué)結(jié)果

電鏡結(jié)果顯示：正常組(圖3A)肝細(xì)胞有豐富的微絨毛，肝細(xì)胞核圓形，居中，核膜清晰，線粒體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，排列緊密，糖原顆粒豐富，僅偶見少量脂滴，無膠原纖維沉積，肝血竇整齊，內(nèi)皮細(xì)胞完整。其他組均可見肝細(xì)胞微絨毛減少及不同程度脂肪變性，脂滴大小不同，可相互融合，將細(xì)胞核擠壓至細(xì)胞一側(cè)，肝細(xì)胞核固縮；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、空泡化；核糖體脫落；線粒體腫脹模糊；Disse間隙增寬，間隙內(nèi)可見不同程度膠原纖維沉積。去除病因組(圖3B)可見輕度脂肪變性及膠原纖維沉積。下瘀血湯組(圖3C)肝細(xì)胞脂肪變性較輕，細(xì)胞結(jié)構(gòu)大致正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張，僅少量膠原纖維沉積。氯沙坦鉀組(圖3D)可見肝細(xì)胞呈彌漫性脂肪變性，纖維化程度比下瘀血湯組重，局部呈彌漫性纖維沉積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯，線粒體模糊。模型組肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)被破壞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈空泡化，核糖體脫落，線粒體腫脹模糊，Disse間隙增寬，間隙內(nèi)可見廣泛膠原纖維沉積，并形成纖維束，甚至可見肝細(xì)胞與肝細(xì)胞之間大量膠原纖維沉積(圖3E)；模型組肝細(xì)胞嚴(yán)重脂肪變性，甚至可見脂滴相互融合(圖3F)。見圖3。

A：正常組；B：去除病因組；C：下瘀血湯組；D：氯沙坦鉀組；E：模型組。：膠原纖維；脂肪變性；左下角μm為圖片標(biāo)尺。

2.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

光鏡下正常肝組織中AT1R、TGF-β1蛋白陽性染色很弱；而去除病因組、下瘀血湯組及氯沙坦鉀組AT1R、TGF-β1表達(dá)逐漸增多，多見于中央靜脈及門靜脈周圍的細(xì)胞；模型組AT1R、TGF-β1表達(dá)最多，分布范圍廣，其中匯管區(qū)周圍細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、纖維間隙、中央靜脈細(xì)胞及部分肝細(xì)胞內(nèi)均可見TGF-β1陽性表達(dá)，著色深染。見圖4及圖5。

A：正常組；B：去除病因組；C：下瘀血湯組；D：氯沙坦鉀組；E：模型組。

2.5 RT-PCR檢測結(jié)果

與正常組相比，其他組RAS各分子(ACE2、ACE、AngⅡ、AT1R)及TGF-β1的mRNA表達(dá)顯著增高，除去除病因組TGF-β1 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)之外，其他各組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，去除病因組、下瘀血湯組、氯沙坦鉀組RAS各分子及TGF-β1的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與去除病因組相比，下瘀血湯組、氯沙坦鉀組RAS分子(ACE、AngⅡ、AT1R)及TGF-β1的mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)。與去除病因組相比，下瘀血湯組ACE2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，氯沙坦鉀組ACE2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與氯沙坦鉀組相比，下瘀血湯組ACE2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，AngⅡ及TGF-β1的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，而ACE、AT1R的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組RAS各分子及TGF-β1的mRNA表達(dá)結(jié)果

2.6 Western-blot檢測結(jié)果

與正常組相比，其他組RAS各分子(ACE2、ACE、AngⅡ、AT1R)及TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，去除病因組、下瘀血湯組、氯沙坦鉀組RAS各分子及TGF-β1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與去除病因組相比，下瘀血湯組、氯沙坦鉀組RAS分子(ACE2、ACE、AngⅡ)及TGF-β1蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)。與去除病因組相比，下瘀血湯組AT1R蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，氯沙坦鉀組AT1R蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與氯沙坦鉀組相比，下瘀血湯組ACE2、AT1R蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，而ACE、AngⅡ和TGF-β1的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組RAS各分子及TGF-β1的蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

RAS失衡與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有關(guān)臨床及實驗研究均證實肝纖維化過程中肝內(nèi)RAS分子有不同程度的上調(diào)[12-13]。為揭示經(jīng)方下瘀血湯潛在的抗肝纖維化機制與RAS自穩(wěn)的相關(guān)性，本研究通過觀察下瘀血湯對RAS促進(jìn)肝纖維化的經(jīng)典通路ACE-AngⅡ-AT1R和抑制肝纖維化的ACE2-Ang(1-7)-Mas通路中相關(guān)因子以及促肝纖維化分子TGF-β1表達(dá)的影響，以探索下瘀血湯是否通過恢復(fù)或重建RAS的自穩(wěn)平衡延緩肝纖維化進(jìn)展。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下瘀血湯可以緩解CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化進(jìn)程，且HE染色、Masson染色及超微病理學(xué)結(jié)果均顯示下瘀血湯組肝纖維化程度比氯沙坦鉀組輕，其緩解肝纖維化的效果優(yōu)于氯沙坦鉀。

本研究結(jié)果還顯示，CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠ACE2、ACE、AngⅡ、AT1R和促肝纖維化分子TGF-β1的基因及蛋白表達(dá)均高于正常大鼠，而去除病因組、下瘀血湯組與氯沙坦鉀組ACE2、ACE、AngⅡ、AT1R和TGF-β1基因及蛋白的表達(dá)高于正常組而低于模型組，說明下瘀血湯與氯沙坦鉀可以通過調(diào)控RAS及TGF-β1的表達(dá)抑制肝纖維化進(jìn)展。電鏡結(jié)果顯示下瘀血湯組肝纖維化程度比氯沙坦鉀組輕；且與氯沙坦鉀組相比，下瘀血湯組ACE2的基因及蛋白表達(dá)顯著升高，ACE、AngⅡ的蛋白表達(dá)顯著降低，AngⅡ的基因表達(dá)也顯著降低。據(jù)此初步推測下瘀血湯通過增強抑制肝纖維化進(jìn)展的ACE2-Ang(1-7)-Mas通路，抑制促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的ACE-AngⅡ-AT1R通路，調(diào)控RAS自穩(wěn)平衡來抑制肝纖維化。

有研究報道，血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑(替米沙坦)能上調(diào)膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠ACE2的表達(dá)且高于模型組[13]，另有研究顯示ACEI類RAS阻滯劑能上調(diào)CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠ACE2的表達(dá)且高于模型組[14]。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯沙坦鉀組ACE2基因及蛋白表達(dá)均低于模型組，這可能與模型制備方法或?qū)嶒炛芷诘牟煌瑢?dǎo)致肝纖維化程度不同有關(guān)。

此外，本研究增加去除病因組以探索去除病因能否阻斷或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)展，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除病因后大鼠肝纖維化進(jìn)展減慢，但并未發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，說明去除病因?qū)Ω卫w維化治療非常重要，然而僅僅去除病因并不能阻斷肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展，仍需進(jìn)行有效的干預(yù)治療方能逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

綜上所述，經(jīng)方下瘀血湯可能通過調(diào)控ACE2介導(dǎo)的RAS自穩(wěn)平衡抑制肝纖維化進(jìn)展，其有關(guān)深層機制還待進(jìn)一步研究與挖掘。