馮 宇 游石瓊 盧洪涌 孫夏瑜 武堅(jiān)銳 張玉萍 王振芳 薛慧琴

1.山西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院兒科醫(yī)學(xué)系（山西太原 030001）；2.山西省兒童醫(yī)院山西省婦幼保健院（山西太原 030013）

發(fā)育遲緩（developmental delay）被定義為患兒有以下某個(gè)或多個(gè)領(lǐng)域發(fā)育實(shí)質(zhì)性延遲：認(rèn)知，社交/個(gè)人發(fā)展，言語/語言，粗略/精細(xì)運(yùn)動(dòng)或日常生活活動(dòng)[1]；也可定義為與同齡人相比，難以達(dá)到平均的發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)育顯著延遲則是指性能低于適齡、標(biāo)準(zhǔn)參考試驗(yàn)平均值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或以上[2]。發(fā)育遲緩的病因十分復(fù)雜，其中遺傳性疾病是主要病因，包括染色體畸變和基因突變，但仍有約50%發(fā)育障礙患者病因未知[1]。除了各種不同類型的發(fā)育遲緩，多數(shù)患者還伴有先天性畸形、自閉癥譜系障礙和/或癲癇等先天性異常，這些往往歸因于多種不同的遺傳性疾病，并且表明發(fā)育障礙疾病具有高度的遺傳異質(zhì)性[3]。低深度全基因組測序（copy number variation sequencing，CNV-seq）技術(shù)是基于高通量測序（high throughput sequencing，HTS）技術(shù)，在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行低深度（通常為0.6X）拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）檢測的方法。與傳統(tǒng)的、基于基因組探針技術(shù)的CNV 檢測技術(shù)，例如染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）相比，CNV-seq的基因組覆蓋性更好，且有更好或類似的分辨率和更短的檢測周期，并且可以檢測相關(guān)的基因信息。因此在HTS已臨床普及的今天，CNV-seq已成為臨床基因檢測推薦的首選檢測方法[4]。本研究利用CNV-seq 對發(fā)育遲緩患兒進(jìn)行基因組CNV 檢測，并結(jié)合核型分析和臨床表型分析病因，探索不同基因組CNV與患者表型之間的關(guān)系，為疾病診斷及再次生育提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 臨床資料

收集2017 至2019 年在山西省兒童醫(yī)院（山西省婦幼保健院）就診的發(fā)育落后患兒的臨床資料。共90例患兒，年齡0～5 歲，男52 例、女38 例。納入患兒至少符合以下1 個(gè)條件：①存在嚴(yán)重體格發(fā)育遲緩，即身材矮?。虎谶\(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙，尤其動(dòng)作協(xié)調(diào)性方面；③智力發(fā)育落后，伴適應(yīng)行為缺陷；④語言發(fā)育遲緩，不包括聽力障礙及構(gòu)音障礙引起的類型。同時(shí)排除因產(chǎn)傷、出生后中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和/或頭顱損傷等非遺傳因素所致者。

本研究經(jīng)過醫(yī)學(xué)倫理審核（No.IRB-KYHZ-2019-006），并獲得患兒或監(jiān)護(hù)人的知情同意。采集患兒外周血2 mL，提取基因組DNA 后進(jìn)行染色體CNV測序。CNV-seq 實(shí)驗(yàn)方案及流程：①從血液中提取DNA，并進(jìn)行質(zhì)量控制；②構(gòu)建DNA 文庫，準(zhǔn)備基因組DNA，然后將DNA 隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭（Adaptor）；③測序，采用hiseq2500測序儀；④生物信息學(xué)分析，檢索DECIPHER、OMIM、ClinVar、DGV等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行CNV片段，包括基因組范圍以及缺失或重復(fù)的功能和關(guān)聯(lián)表型的注釋。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南[5]將CNV 分為臨床致病性、臨床可能致病性、臨床意義不確定性（variant of uncertain significance，VOUS）、可能良性和良性的CNVs。

90例患兒中，48例合并有其他癥狀，包括心血管系統(tǒng)7例、特殊面容/結(jié)構(gòu)畸形22例、孤獨(dú)癥譜系障礙4 例、其他表型15 例，以特殊面容或其他多發(fā)畸形較為常見。意義未明的CNV患兒中，13例合并發(fā)育遲緩以外的其他表型：先心病2例（心肌肥厚1例、室間隔缺損1例）、自閉癥2例、先天性異常/畸形10例（先天性失明1例，肌無力2例，肌張力增高1例，足內(nèi)翻1例，足外翻1 例，鞘膜積液1 例，右手缺如1 例，皮膚色素沉著1例，雙手姿勢異常1例）、特殊面容2例。

90例患兒經(jīng)CNV-seq技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，致病性CNV檢出相對高頻的是7、8和22號(hào)染色體，檢測出致病性或可能致病性CNV 18例（表1），陽性率為20.0%；而用染色體核型分析技術(shù)僅檢測出7 例染色體異常，陽性率為7.8%（表2）。檢測出意義未明的CNV 32 例（35.6%），其中男性20例，女性12例。臨床意義未明的基因組CNN共42個(gè)，其中微缺失31個(gè)、微重復(fù)11個(gè)，染色體CNN相對高頻的是1、3、4號(hào)染色體，1 Mb及以下的CNV有33個(gè)。

CNV-seq技術(shù)檢出的致病性CNV中，5例同時(shí)存在染色體核型異常（表2）。其中3 例患兒（P 9～P 11）為染色體數(shù)目異常，分別為13、18和21三體綜合征，1例(P12)為19.84 Mb大片段缺失，能夠解釋發(fā)育遲緩表型。1例（P1）核型為47,XY,+mar，mar為額外的染色體片段，但染色體核型無法鑒定與患兒表型相關(guān)，而CNV-seq檢測明確了mar為15號(hào)染色體8.92 Mb的重復(fù)片段，該片段重復(fù)可引起15q11-q13缺失綜合征，與發(fā)育遲緩、智力障礙有關(guān)。此外，1例（P19）為羅氏易位攜帶者，核型為45,XY,rob(13,14)，染色體核型無法解釋發(fā)育遲緩表型，而用CNV-seq技術(shù)檢測出該患兒3號(hào)染色體上存在0.48 Mb微重復(fù)，為臨床意義未明的染色體拷貝數(shù)變異。1 例（P 20）女性患兒存在X與11號(hào)染色體平衡易位，但CNV-seq技術(shù)未發(fā)現(xiàn)染色體拷貝數(shù)變異。

2 討論

兒童各種發(fā)育障礙是許多高度遺傳異質(zhì)性疾病的主要表型，從單個(gè)基因的點(diǎn)突變，到大的染色體變異均可能導(dǎo)致發(fā)育遲緩。以往利用CMA 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，約15%～20%的兒童發(fā)育遲緩患者歸因于CNV[6-9]，這與本研究利用CNV-seq 所得到的診斷率一致。CNV-seq 技術(shù)基于其高通量測序技術(shù)，在實(shí)現(xiàn)相同分辨率的基礎(chǔ)上，檢測的效率更高[10]，這對臨床診斷尤其重要。由于發(fā)育遲緩的遺傳異質(zhì)性，在診斷時(shí)往往需要多種基因檢測方法聯(lián)合應(yīng)用，以避免遺漏某種基因變異方式，而相同的高通量測序流程最大程度地保證了各種基因檢測方法的高效性，以及得益于流程高度自動(dòng)化結(jié)果的穩(wěn)定性。

本研究應(yīng)用CNV-seq 技術(shù)檢測90 例發(fā)育遲緩患兒的基因組拷貝數(shù)變異，致病性CNV檢出相對高頻的是7、8 和22 號(hào)染色體，且檢出的微缺失/重復(fù)片段大多已知與發(fā)育遲緩疾病密切相關(guān)，表明這些高頻致病性CNV具有全球性的流行病學(xué)特征，包括了Williams綜合征、8q21.11微缺失綜合征和22q11缺失綜合征等。在15 例檢出臨床致病性CNV 的患兒中，診斷為Williams-Beuren綜合征（WBS）就有2例（P7和P15）。對比2例WBS患兒，P15缺失序列長度為1.40 Mb，小于P7 的1.70 Mb 缺失，但2 例患兒的CNV 均包含有WBS關(guān)鍵基因ELN（OMIM：*130160）的缺失。盡管目前定義WBS是由7q11.23的1.5～1.78 Mb的微缺失引起[11]，而P15雖然缺失長度為1.40 M，小于WBS常見的CNV，但2 例患兒都有相同的語言發(fā)育遲緩，表明導(dǎo)致WBS的主要表型可定位到更小的基因組區(qū)域，例如可能是核心基因ELN上，這為WBS 基因型-表型研究提供了的案例材料。

表1 18例 CNV-seq檢測結(jié)果陽性患兒的臨床表型及CNV結(jié)果

表2 染色體核型異常及其相應(yīng) CNV-seq 檢測結(jié)果

P8為8 q21.11-q21.13缺失，長度為7.6 Mb，包含已知的8 q 21.11 微缺失綜合征（OMIM：#614230）CNV 全長，并且精神發(fā)育遲緩（智力障礙）和特殊面容的表型也一致，因此得到確診；P13的8q24.22-q24.3有長達(dá)10.64 Mb的重復(fù)，至2歲齡時(shí)表現(xiàn)為孤立性語言發(fā)育遲緩。盡管該CNV 還沒有明確的致病案例報(bào)導(dǎo)，然而8q24.3 2.3Mb的倒位重復(fù)與8q24.3微缺失均有導(dǎo)致多種發(fā)育遲緩的報(bào)道[12-14]，其中有重度精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、智力障礙、面部畸形和癲癇。由此可見，8q24.22-q24.3，特別是8q24.3所關(guān)聯(lián)表型的基因位點(diǎn)還有待進(jìn)一步精確定位。

CNV-seq所能檢測的理論最大分辨率為100 kb[10]。本研究設(shè)置的閾值為200 kb 及以上為陽性CNV，以減小假陽性誤差，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，致病性微缺失/微重復(fù)的片段大小均＞1 Mb，而VOUS 或良性CNV 片段則有79.5% ＜1 M，表明CNV的大小與其致病性呈正相關(guān)，這可能是評估CNV致病性的依據(jù)之一，與捷克發(fā)育遲滯/智力障礙障兒童CNV研究發(fā)現(xiàn)一致[15]。此外，與VOUS類別相比，致病性CNV中微缺失的頻率是微重復(fù)的2倍（10 :5），而在VOUS類中，微重復(fù)更為頻繁。這可能是由于對劑量敏感的單倍體基因來說，雜合性缺失的致病性往往比雜合性重復(fù)具有更高的致病性，并導(dǎo)致更嚴(yán)重的表型，這與大多數(shù)遺傳性疾病為功能缺失（loss of function，LOF）而非功能獲得（gain of function，GOF）變異的現(xiàn)象一致[16-17]，而對于微重復(fù)CNV，其引起的單個(gè)基因序列中斷可能是致病的主要原因。

此外，本研究檢出的VOUS 共32 例，占35.6 %（32/90），微缺失/重復(fù)共有42個(gè)，其中僅8個(gè)（19.05%）片段＞1 M，并且這些微缺失/重復(fù)主要集中在3、4號(hào)染色體，這種CNV大小和分布的特征與表型的關(guān)聯(lián)有待近一步研究闡明。對于CNV檢測陰性患者，應(yīng)當(dāng)聯(lián)合其他基因檢測技術(shù)，例如基于捕獲的高通量測序技術(shù)panel或全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES），進(jìn)一步尋找致病性點(diǎn)突變和小的插入/缺失。

本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育遲緩患兒中合并表型主要包括特殊面容、先天性心臟病、孤獨(dú)癥譜系障礙、畸形等，致病性/可能致病性CNVs患兒中，特殊面容（10/18）是陽性率最高的表型，表明特殊面容（唇腭裂、眼距寬、耳位低、小下頜等）是判斷其致病性的重要指標(biāo)。本組90 例患兒通過染色體微缺失微重復(fù)片段，進(jìn)行基因分析（ClinGen、DECIPHER、DGV等數(shù)據(jù)庫），并找到可能與發(fā)育遲緩癥狀相關(guān)的候選基因（表1）。與VOUS 患者比較，兩者的臨床表型主要區(qū)別在于：致病性/可能致病性CNVs 患者中，發(fā)育遲緩合并先天性心臟病、多發(fā)畸形/特殊面容及其他表型的患兒占78%（14/18）；而VOUS 患兒中，合并其他癥狀者僅占40.6%（13/32）。這表明含有許多基因或已知疾病基因的CNVs 比含有很少基因或功能不確定基因的CNVs更有可能致病。且大片段CNVs比小片段CNV更易引起臨床表型，因?yàn)樗鼈兊闹虏』蛲ǔ８?。其中，VOUS患兒中合并ASD（2例）的頻率要高于致病性/可能致病性患兒中合并ASD 的頻率[9]，表明合并有ASD 的發(fā)育遲緩患兒CNV 片段更加復(fù)雜，更難以解釋其表型狀況。

總之，CNV-seq作為一種基于高通量測序技術(shù)的基因檢測方法，具有快速和便于與其他高通量基因檢測技術(shù)聯(lián)合使用的優(yōu)勢。CNV-seq在發(fā)育遲緩疾病中的檢測優(yōu)勢遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過核型分析，在產(chǎn)前診斷甚至高危人群產(chǎn)前篩查中有廣闊的應(yīng)用前景，將能夠有效降低兒童相關(guān)疾病的發(fā)病率和家庭社會(huì)的負(fù)擔(dān)，對再次妊娠有重要的指導(dǎo)意義。然而，由于正常人CNVs 數(shù)據(jù)庫還不完善，導(dǎo)致部分檢測到的CNVs 臨床意義判斷困難，還需要更多的病例報(bào)道及進(jìn)一步完善的相關(guān)檢查明確。