周娟 程素平

（1，江蘇省南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 226000；2，江蘇省海安市畜牧獸醫(yī)站 226600）

小反芻獸疫又稱“羊瘟”，是由副粘病毒科 （Paramyxoviridac）麻疹病毒屬中的小反芻獸疫病毒引起的羊的高度接觸性動(dòng)物傳染病，山羊最易感，易感羊群的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[1]。該病是OIE 法定報(bào)告動(dòng)物疫病，也是全球計(jì)劃根除的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。2012 年國(guó)務(wù)院辦公廳發(fā)布《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020 年)》，明確將其列入13 種重點(diǎn)防范的外來(lái)動(dòng)物疫病。

2007 年小反芻獸疫首次傳入我國(guó)西藏阿里地區(qū)，2013 年11 月底小反芻獸疫再次傳入我國(guó)，疫情波及多個(gè)省份[2]。2015年南通市各市、縣、區(qū)由于從外地調(diào)運(yùn)未經(jīng)嚴(yán)格檢疫的活羊而引發(fā)疫情，全市畜牧獸醫(yī)部門迅速行動(dòng)，疫情得到有效控制，最大程度降低疫情造成的損失。

南通市是養(yǎng)羊大市，年養(yǎng)殖量約320 萬(wàn)只。切實(shí)做好小反芻獸疫防控工作，事關(guān)養(yǎng)羊業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。本病主要通過(guò)直接接觸傳染，病畜的分泌物和排泄物是傳染源，處于亞臨床型的病羊尤為危險(xiǎn)?；疾⊙蛑饕憩F(xiàn)為體溫升高、口炎、肺炎、腹瀉、眼部、鼻腔處有漿液性分泌物等。小反芻獸疫潛伏期為4～5d，最長(zhǎng)21d，自然發(fā)病僅見(jiàn)于山羊和綿羊，嚴(yán)重爆發(fā)時(shí)死亡率達(dá)100%，幼年動(dòng)物感染后發(fā)病率和死亡率都很高。小反芻獸疫屬于外來(lái)疫病的一種，隨著南通市畜牧業(yè)的快速發(fā)展，與外界的物種交流逐漸頻繁，特別是活羊調(diào)運(yùn)頻繁，易發(fā)生小反芻獸疫[3]。為進(jìn)一步做好小反芻獸疫防控工作，貫徹落實(shí)《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃》 （農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2015〕 34 號(hào)），和《關(guān)于印發(fā)2019 年南通市動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查工作方案的通知》 （通農(nóng)牧〔2019〕 37 號(hào)），科學(xué)評(píng)估疫情風(fēng)險(xiǎn)與防控效果，更好地保障畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，了解南通市7 個(gè)縣（市）區(qū)羊群的小反芻獸疫免疫抗體水平和流行情況，于2019年10 月底至11 月初采用ELISA 方法和熒光RT-PCR 方法對(duì)采集的435 份羊血清和125 份口鼻拭子進(jìn)行集中監(jiān)測(cè)，為制定小反芻獸疫的防控措施和消滅小反芻獸疫提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 被檢血清樣品

南通市各縣（市）、區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心依據(jù)《關(guān)于秋防集中監(jiān)測(cè)送樣的通知》 （通疫控〔2019〕 30 號(hào)）于11 月11 日前根據(jù)各縣（市）、區(qū)的送樣任務(wù)以隨機(jī)的方式采集符合要求的血清樣品共345 份、口鼻拭子樣品125 份送至南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，簡(jiǎn)稱被動(dòng)送樣。

《關(guān)于開(kāi)展全市秋季重大動(dòng)物疫病防疫工作檢查及飛行監(jiān)測(cè)采樣的通知》 （通疫控〔2019〕 31 號(hào)）由南通市級(jí)在養(yǎng)殖量較高的6 個(gè)縣(市) 區(qū)中隨機(jī)抽取海安、如皋、如東3 個(gè)縣（市）區(qū)，于11 月5～8 日由市級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心檢查組采取現(xiàn)場(chǎng)查閱相關(guān)資料和采樣相結(jié)合的方法進(jìn)行檢查，每個(gè)縣（市）區(qū)隨機(jī)抽查2 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)檢查1 個(gè)規(guī)模羊場(chǎng)及1個(gè)禽場(chǎng)（不與縣級(jí)抽查重復(fù)），由檢查組人員全程參與采樣并按規(guī)定封存保管交檢查組人員當(dāng)日帶回南通市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，常規(guī)分離血清樣品并編號(hào)。3 個(gè)縣（市）共采集羊血樣90 份，簡(jiǎn)稱飛行采樣。

2019 年秋防集中監(jiān)測(cè)共采集29 個(gè)羊場(chǎng)血樣435 份、口鼻拭子125 份，詳見(jiàn)表1。

1.1.2 檢測(cè)試劑和主要儀器

小反芻獸疫病毒阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)：020171907）和小反芻病毒野毒特異性熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：040211903）均購(gòu)自青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心，酶標(biāo)儀sunrise、熒光PCR 儀7500、Eppendorf 移液器等其余儀器和耗材為本實(shí)驗(yàn)室自備。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 ELISA 檢測(cè)原理及方法

采用小反芻獸疫診斷技術(shù)（GB/T 27982-2011）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，利用阻斷ELISA 原理檢測(cè)羊血清中小反芻獸疫病毒抗體，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.2 ELISA 判定標(biāo)準(zhǔn)

在陽(yáng)性對(duì)照阻斷率（PB）＞60，陰性對(duì)照阻斷率（PB）＜40，試驗(yàn)結(jié)果成立的前提下，被檢樣品的阻斷率＞50，判為陽(yáng)性，被檢樣品的阻斷率≤50，判為陰性。

表1 南通市秋防集中監(jiān)測(cè)羊樣品明細(xì)表

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)原理及方法

用自動(dòng)核酸提取儀提取各類樣本中的RNA，每份被檢樣品使用1 個(gè)PCR 管，每管中依次加入：熒光RT-PCR 反應(yīng)液21ml，酶混合液1ml，被檢樣品中提取RNA 溶液3ml。每次檢測(cè)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。加樣后，將PCR 管置于熒光PCR儀內(nèi)進(jìn)行如下反應(yīng)：50℃反轉(zhuǎn)錄15min；95℃，3min；然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)的PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃15s，60℃45s，在每個(gè)循環(huán)的第二步（60℃45s）收集熒光信號(hào)，其中報(bào)告熒光為FAM。

1.2.4 RT-PCR 判定標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線且Ct 值＜35，陰性對(duì)照無(wú)Ct值且無(wú)特異性擴(kuò)增曲線。如果被檢樣品的Ct 值≤35 且有特異性擴(kuò)增曲線則結(jié)果判為野毒株陽(yáng)性；若Ct 值＞35 則判為野毒株陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2019 年南通市秋季集中監(jiān)測(cè)對(duì)采集的4 個(gè)場(chǎng)125 份口鼻拭子采用熒光RT-PCR 方法進(jìn)行小反芻獸疫病毒野毒株病原學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，表明南通市沒(méi)有小反芻獸疫野毒株感染。

2.2 血清抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 南通市各縣（市）區(qū)被動(dòng)送樣樣品的免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

由表2 可知，2019 年秋季南通市羊小反芻獸疫被動(dòng)送樣的7 個(gè)縣（市）區(qū)23 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶）345 份樣品的小反芻獸疫抗體陽(yáng)性率平均為98.55%、平均阻斷率為89.32%，高于國(guó)家規(guī)定的70%的標(biāo)準(zhǔn)，表明南通市小反芻獸疫防疫情況較好，免疫效果達(dá)到較高水平。

2.2.2 “飛行采樣” 的縣（市）羊小反芻獸疫免疫抗體檢測(cè)

由表3 可知，“飛行采樣” 采集3 個(gè)縣（市）6 個(gè)場(chǎng)90 份樣品羊小反芻獸疫免疫抗體平均陽(yáng)性率96.67%，平均阻斷率89.29%；僅有1 個(gè)場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率為80%，阻斷率為81.09%，其余場(chǎng)的陽(yáng)性率均為100%。說(shuō)明飛行采樣的羊場(chǎng)小反芻獸疫免疫效果也較好，均超過(guò)國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.3 南通市各縣（市）區(qū)的羊小反芻獸疫免疫抗體秋防集中檢測(cè)

由表4 可知，南通市7 個(gè)縣（市）區(qū)的435 份樣品中有427 份羊小反芻獸疫陽(yáng)性，陽(yáng)性率為98.16%，所有縣（市）區(qū)的羊小反芻獸疫免疫抗體陽(yáng)性率均高于95%，且平均阻斷率也達(dá)到89.32%，說(shuō)明南通市的羊小反芻獸疫的免疫水平在動(dòng)物疫病防控系統(tǒng)的全體同志的共同努力下取得了較好的免疫效果，為重大動(dòng)物疫病的防控打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為逐步消滅羊小反芻獸疫打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 討論

（1）南通市2019 年秋防集中監(jiān)測(cè)羊小反芻獸疫的免疫抗體陽(yáng)性率超過(guò)了國(guó)家規(guī)定的70%的標(biāo)準(zhǔn)，且小反芻獸疫的病原學(xué)檢測(cè)也均為陰性，表明南通市羊群免疫抗體水平較高且養(yǎng)殖環(huán)境也是清凈的。小反芻獸疫是我國(guó)中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012～2020 年）優(yōu)先防治和重點(diǎn)防范的動(dòng)物疫病之一，南通市的各縣（市）區(qū)政府通過(guò)購(gòu)買服務(wù)，防疫員包村包戶，每年進(jìn)行二次重大動(dòng)物疫病普免、夏季集中補(bǔ)免和消毒滅源三大行動(dòng)，同時(shí)監(jiān)督規(guī)模羊場(chǎng)按本場(chǎng)疫苗免疫程序進(jìn)行免疫并逐步完善綜合防控措施，使小反芻獸疫得到一定程度的控制，因此，近年來(lái)未曾見(jiàn)疫病發(fā)生。

表2 南通市各縣（市）區(qū)被動(dòng)送樣樣品的免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

表3 “飛行采樣” 的縣（市）羊小反芻獸疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

表4 南通市各縣（市）區(qū)小反芻獸疫免疫抗體檢測(cè)結(jié)果匯總

（2）目前，小反芻獸疫尚無(wú)有效的治療措施，實(shí)行小反芻獸疫強(qiáng)制免疫是最有效的防治措施，小反芻獸疫疫苗對(duì)溫度非常敏感，運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)采用全程冷鏈運(yùn)輸?shù)姆绞?。抗體檢測(cè)和病原學(xué)監(jiān)測(cè)是評(píng)估小反芻獸疫疫苗的免疫效果，科學(xué)制定免疫程序的重要手段，本次檢測(cè)的小反芻獸疫病毒阻斷ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒和小反芻病毒野毒特異性熒光RT-PCR 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自青島立見(jiàn)，檢測(cè)結(jié)果表明，南通市2019 年所有縣（市）區(qū)的羊小反芻獸疫免疫抗體陽(yáng)性率達(dá)98.16%，且平均阻斷率也達(dá)到89.32%，“飛行采樣” 采集3 個(gè)縣（市）6 個(gè)場(chǎng)90 份樣品羊小反芻獸疫免疫抗體平均陽(yáng)性率96.67%，平均阻斷率89.29%；病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果也均為陰性。南通市重大動(dòng)物疫病的防疫工作是在監(jiān)管員的監(jiān)督下，防疫員領(lǐng)取政府統(tǒng)一招標(biāo)采購(gòu)的疫苗（全程冷鏈運(yùn)輸），規(guī)模羊場(chǎng)由自場(chǎng)防疫員進(jìn)行防疫，散養(yǎng)戶由防疫員上門進(jìn)行防疫并詳細(xì)記錄免疫時(shí)間、疫苗批號(hào)、生產(chǎn)廠家等信息，各縣（市）區(qū)重大動(dòng)物疫病指揮部定期或不定期進(jìn)行檢查，南通市一年兩次進(jìn)行“飛行采樣” 檢查，經(jīng)過(guò)近幾年的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，全市防疫密度和防疫質(zhì)量有了大幅提高，也多次得到省表?yè)P(yáng)。此次檢測(cè)結(jié)果也表明，南通市小反芻獸疫免疫效果較好，病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明近期內(nèi)發(fā)生小反芻獸疫的風(fēng)險(xiǎn)較低。

（3）獸醫(yī)工作者和養(yǎng)羊場(chǎng)（戶）應(yīng)注意以下幾個(gè)方面的工作：一是加強(qiáng)羊只的引種檢疫和流通環(huán)節(jié)監(jiān)管，加強(qiáng)小反芻獸疫防控技術(shù)的宣傳指導(dǎo)，提高基層獸醫(yī)工作者和養(yǎng)殖戶的防控意識(shí)，最終實(shí)現(xiàn)小反芻獸疫的消滅計(jì)劃；二是加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和羊場(chǎng)環(huán)境控制，保證動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)均衡；三是選擇合適、質(zhì)量過(guò)關(guān)的疫苗與藥物，制訂合理的免疫和用藥方案，充分發(fā)揮疫苗及藥物的作用，做好新老疫病的控制和預(yù)防工作；四是實(shí)行嚴(yán)格的生物安全措施；五是羊場(chǎng)特別是規(guī)模化羊場(chǎng)要做好疫病的定期診斷與監(jiān)測(cè)，有針對(duì)性采取防控措施。

（4）病原學(xué)和抗體集中檢測(cè)對(duì)羊小反芻獸疫的免疫效果評(píng)價(jià)及免疫程序的制定有重要指導(dǎo)意義，對(duì)調(diào)整優(yōu)化免疫程序、保證疫苗免疫效果至關(guān)重要。此次檢測(cè)結(jié)果表明，南通市轄區(qū)羊場(chǎng)免疫抗體陽(yáng)性率均較高，良好的防疫質(zhì)量在重大動(dòng)物疫病防控中有不可替代的作用。南通市每年組織2 次集中監(jiān)測(cè)和“飛行采樣” 檢查，既是對(duì)縣（市）區(qū)進(jìn)行考核，也對(duì)規(guī)模羊場(chǎng)和散養(yǎng)戶的防疫有促進(jìn)作用，及時(shí)掌握小反芻獸疫群體免疫力，對(duì)小反芻獸疫的預(yù)防、控制、凈化和消滅具有積極的推動(dòng)作用，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)戶宣傳生物安全的重要性，督促養(yǎng)殖戶加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好綜合防控工作，提高羊群的抵抗力，保障養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。