余愛(ài)紅 晏紅星

1.湖北省黃岡市黃州區(qū)人民醫(yī)院藥劑科 (湖北 黃岡， 438000) 2.湖北省黃岡市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

肝纖維化是多種因素導(dǎo)致的肝細(xì)胞炎癥產(chǎn)生和細(xì)胞壞死，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積和細(xì)胞因子失衡，并刺激肝纖維細(xì)胞生成的病理性過(guò)程。是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段[1]。四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[2]，是目前研究肝纖維化最常用的模型，適用于藥物治療肝纖維化的藥理學(xué)研究。

健肝樂(lè)顆粒中含有白芍和甘草，處方源自于經(jīng)典名方“芍藥甘草湯”。有現(xiàn)代研究報(bào)道，甘草酸類制劑可以作為保肝藥物治療肝病，其主要的作用成分是甘草酸和甘草苷[3,4]。芍藥多苷作為中藥白芍提取度最高且起治療作用活性成分[5,6]，同時(shí)芍藥苷也是健肝樂(lè)顆粒檢測(cè)主要成分，芍藥苷具有多種生物學(xué)活性且不良反應(yīng)小。本研究旨在明確健肝樂(lè)顆?？垢卫w維化的藥效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)的SD大鼠50只，體重220～250 g，雌雄各半，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 藥品、試劑與儀器 健肝樂(lè)顆粒由武漢康樂(lè)藥業(yè)股份有限公司提供，CCl4由江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司提供；ALT、AST、SOD、MDA、GSH-PX、TNF-α、IL-1β、HA、LN、HYP等試劑盒由武漢科瑞生物技術(shù)有限公司提供。應(yīng)用ESJ120-4電子天平，PTT-A600電子天平，XHF-D高速分散器，TG-16W臺(tái)式高速離心機(jī)，TDL-5A低速大容量離心機(jī)，Biotek Eon微孔板分光光度計(jì)等儀器設(shè)備。

1.3 建立肝纖維化的動(dòng)物模型及干預(yù)方法 將50只大鼠計(jì)算機(jī)隨機(jī)分成5組，為正常組，模型組，健肝樂(lè)高、中、低劑量組，每組10只。除正常組給予相應(yīng)劑量花生油外，其余4組于大鼠背部給予50% CCl4(0.2 ml/100 g)皮下注射。1周造模處理2次，連續(xù)12周。正常組和模型組在造模第5周起，進(jìn)行蒸餾水灌胃處理，健肝樂(lè)低、中、高劑量組進(jìn)行受試藥灌胃，1次/d，持續(xù)給藥8周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及方法 眼眶靜脈叢采血，測(cè)定血清中ALT、AST、TNF-α、IL-1β、HA、LN水平。頸椎脫臼處死SD大鼠，精確稱取大鼠肝、腎、脾三個(gè)臟器和胸腺的重量，并計(jì)算臟器指數(shù)。用分光光度法測(cè)定肝組織勻漿HYP、TNF-α、MDA的含量，以及SOD和GSH-PX活性[7]。并在同一部位切取肝臟組織，石蠟切片制備過(guò)程采用4%的甲醛進(jìn)行固定。采用HE染色，在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察[8]。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠體重和死亡率比較 模型組大鼠與正常組大鼠比較，12周后的體質(zhì)量增長(zhǎng)值降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，各受試組的體重變化與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)死亡率分析發(fā)現(xiàn)，健肝樂(lè)高、中劑量組死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。健肝樂(lè)低劑量組與正常組的死亡率為0，低于其他受試組，表明健肝樂(lè)對(duì)動(dòng)物的損傷較輕，同時(shí)在合適劑量時(shí)，具有明顯的肝、腎、脾保護(hù)作用，可以修復(fù)大鼠機(jī)體損傷，降低死亡率。見(jiàn)表1。

2.2 5組大鼠臟器指數(shù)比較 見(jiàn)表2。

2.3 5組大鼠血清生化指標(biāo)比較 健肝樂(lè)中、低劑量組在降低ALT、AST具有明顯的優(yōu)勢(shì)；在降低IL-1β、HA、LN、HYP指標(biāo)中，健肝樂(lè)中、低劑量組較模型組具有明顯改善作用。見(jiàn)表3。

2.4 5組大鼠肝組織中SOD、GSH-PX的活性與TNF-α、MDA的比較 見(jiàn)表4。

2.5 肝組織切片HE染色結(jié)果 見(jiàn)圖1，正常組大鼠肝小葉脈路清晰組織完整，細(xì)胞有序排布。細(xì)胞無(wú)損傷，細(xì)胞核呈圓形，位于細(xì)胞中央。模型組大鼠肝小葉脈路模糊組織不完整，肝細(xì)胞混亂無(wú)序。肝細(xì)胞損傷，伴隨有一定程度的肝細(xì)胞變性和點(diǎn)片狀壞死。與人體產(chǎn)生的肝纖維化相類似，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和膠原纖維增多，在部分區(qū)域出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。通過(guò)藥物干預(yù)，健肝樂(lè)中、低劑量組大鼠肝組織的炎性浸潤(rùn)、纖維增生和病灶壞死明顯少于模型組大鼠。

3 討論

肝纖維化相關(guān)研究證明，纖維化形成原因與肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過(guò)氧化相關(guān)，抗纖維化的藥物作用機(jī)制與抗氧化密切聯(lián)系。轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞破損或受外界刺激時(shí)，肝內(nèi)容物進(jìn)入血液，導(dǎo)致血清中轉(zhuǎn)氨酶異常升高。因此臨床治療肝功能異常以轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)變化作為的主要的療效參考指標(biāo)之一。而SOD和GSH-PX兩種酶的活性強(qiáng)弱，反映了機(jī)體抗氧化清除氧自由基的能力[10]。肝纖維化是由于ECM的分泌和代謝失衡、肝細(xì)胞氧化和抗氧化的失衡，導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)大量堆積，刺激肝星狀細(xì)胞(HSC)及膠原增多。因此HSC的激活、ECM沉積與基質(zhì)降解能力下降是肝纖維化形成的關(guān)鍵因素[11]。而氧化應(yīng)激能促使HSC的活化，轉(zhuǎn)化成為纖維細(xì)胞以及纖維細(xì)胞的大量合成。肝臟膠原纖維和血清中分別含有HYP、HA，二者的含量變化可反映肝纖維的活動(dòng)狀態(tài)和纖維化程度；肝竇毛細(xì)血管化和ECM在匯管區(qū)的增生，都影響到LN的合成分泌；三者可較敏感地反映肝纖維化的情況[12]。同時(shí)，據(jù)最新研究報(bào)道，肝纖維化的形成還與肝細(xì)胞因子有關(guān)，肝纖維化引起細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β水平升高；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的含量能影響HSC的活化，降低α-SMA的含量能可有效抑制肝纖維化[13]。

圖1 實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織切片(HE染色)

健肝樂(lè)顆粒白芍和甘草組方，來(lái)源于東漢醫(yī)圣張仲景的經(jīng)典名方“芍藥甘草湯”，原方具有緩急止痛、柔肝舒筋的功效[14]。健肝樂(lè)顆粒則是根據(jù)中醫(yī)理論進(jìn)行隨癥加減，并運(yùn)用現(xiàn)代制藥工藝精制成藥，在保留原方緩急止痛功效之外，還增強(qiáng)了芍藥的養(yǎng)血護(hù)肝的效力，廣泛應(yīng)用于各種原因引起的肝功能異常的臨床治療[15]。上述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，健肝樂(lè)顆粒能夠增強(qiáng)SOD、GSH-PX活性，提高肝細(xì)胞抗氧化的能力，減輕肝損傷產(chǎn)生MDA，同時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)TNFα、IL-1β等細(xì)胞因子的表達(dá)，改善ECM的異常增生，減少基質(zhì)堆積和HSC的活化，達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的效果；健肝樂(lè)顆粒在抗氧化能力和改善肝纖維化各項(xiàng)生理指標(biāo)效果方面，具有明顯的治療優(yōu)勢(shì)。以上研究結(jié)果為健肝樂(lè)顆粒在肝纖維化疾病中的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供了藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。