黃海堂 吳輝坤,2,3△ 皇甫炎林 潘 誼

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 (湖北 武漢， 430061) 2.湖北省中醫(yī)院 3.湖北省中醫(yī)藥研究院 4.寧波市奉化區(qū)中醫(yī)醫(yī)院

肝癌具有總生存期短、病死率高的特點，是目前世界上第二大癌癥相關(guān)死亡原因，也是世界上第五大最常見的惡性腫瘤[1, 2]。肝癌是湖北省中醫(yī)院肝病研究所的重點研究病種之一，對肝癌的辨證論治經(jīng)歷了從“毒”到“毒痰瘀”再到“毒痰瘀虛”的過程。我們對肝癌門診1 242例原發(fā)性肝癌患者的處方藥物進行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)肝癌的臨床治療中，解毒常用茵陳蒿、黃連等，化痰常用薏苡仁、枳實等，祛瘀常用丹參、郁金，補虛常用茯苓、白術(shù)等[3]，綜合全國名老中醫(yī)吳壽善醫(yī)師治療肝癌的用藥特點，我們對治療肝癌的31味高頻中藥進行了篩選，初步形成了針對“毒、痰、瘀、虛”證候要素的中復(fù)藥方毒痰瘀脾腎虛方。為了進一步闡明肝癌“毒、痰、瘀、虛”四大證候要素的科學(xué)性及其本質(zhì)，我們根據(jù)毒痰瘀脾腎虛方組方的證候要素特點進行拆方、組方，形成了全方、脾虛方、腎虛方、腎陽虛方、腎陰虛方、毒痰瘀方6大組方，通過體外細胞實驗分析各組方含藥血清對HepG2細胞凋亡、Wnt/β-catenin 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物和細胞 雄性Wistar大鼠(180～220 g)購自武漢大學(xué)實驗動物中心；HepG2細胞由武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)公司提供，批號為CL-0341。

1.1.2 藥物組成及制劑方法 毒痰瘀方：葉下珠、旋覆花、皂角刺各10 g，半枝蓮、蛇舌草各15 g、天葵子、丹參、姜黃各20 g、黨參30 g；腎虛方：毒痰瘀方加干地黃、續(xù)斷、沙苑子各20 g；腎陽虛方：毒痰瘀方加續(xù)斷、沙苑子各20 g；腎陰虛方：毒痰瘀方加干地黃20 g；脾虛方：毒痰瘀方加炙黃芪、白術(shù)各30 g；全方：毒痰瘀方加炙黃芪、白術(shù)各30 g，干地黃、續(xù)斷、沙苑子各20 g。所用中藥購自我院藥劑科。計算藥物總克數(shù)，加10倍蒸餾水，倒入鍋中煎煮1 h后用紗布過濾出濾液待用；藥渣加10倍蒸餾水再煎1次，過濾；把兩次得到的濾液倒入鍋內(nèi)加熱濃縮至2 g/ml(即每ml含有2 g生藥)，裝瓶，放入冰箱備用。

1.1.3 實驗器材 超凈工作臺購自蘇州集團安泰空氣技術(shù)有限公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購自SANYO公司，倒置顯微鏡購自NIKON公司，低速離心機購自Eppendorf公司，電泳儀電源、垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)儀購自北京六一儀器廠，酶標(biāo)儀購自Thermo公司。

1.1.4 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，0.25% Trypsin血清購自GIBCO，F(xiàn)BS公司，青霉素-鏈霉素溶液(雙抗,100×)購自Procell公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司，細胞凋亡實驗所需其他化學(xué)試劑購自國產(chǎn)分析純，磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司，TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺購自Amresco公司，Trise-Base、二硫叔糖醇、購自Biosharp公司、蛋白marker(10～250 kD)購自Fermentas公司，小鼠單抗β-actin 、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，兔多抗p-GSK3β(46 kD)購自Affinity公司，余檢測抗體均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，X光膠片購自柯達公司，顯影定影試劑盒購自天津市漢中攝影材料廠，Western Blot檢測其他化學(xué)試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備含藥血清 雄性Wistar大鼠27只隨機分為9組，即空白組、陰性血清組、索拉菲尼組、全方組、脾虛組、腎虛組、腎陽虛組、腎陰虛組、毒痰瘀組，每組3只。中藥組大鼠分別予以相應(yīng)藥物濃縮液灌胃，灌胃體積為10 ml/kg，陰性血清組以等體積生理鹽水灌胃，空白組不予處理，索拉菲尼組予以50 mg/kg索拉菲尼灌胃，2次/d(每次間隔6 h)，連續(xù)5 d，于末次給藥后1 h乙醚麻醉，無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血，每只大鼠平均采血8 ml，冷置1 h后，放入離心機中離心(2 500 r/min，25 min)分離血清,最終每組平均分離出2.5 ml血清，將血清放置56℃水浴中滅活30 min，加入DMEM培養(yǎng)液中，制成10%含藥血清培養(yǎng)液備用。

1.2.2 細胞復(fù)蘇和培養(yǎng) 將HepG2細胞從液氮中取出，水浴鍋中溶解后轉(zhuǎn)移至含有5 ml培養(yǎng)基(1640+10%FBS+1%Penicillin-Streptomycin Solution)的離心管中，室溫1 000 r/min離心5 min，收集細胞；用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞，接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，置于37℃、5% CO2飽和濕溫度條件下培養(yǎng)；細胞的密度達到80% 時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗一遍，加入胰蛋白酶消化后加入完全培養(yǎng)基，按1∶3的比例傳代，37℃、5% CO2飽和濕溫度條件下擴大培養(yǎng)；取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，再次加入胰蛋白酶消化細胞，消化完成后快速棄去胰酶，加入完全培養(yǎng)基，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，去上清，HepG2細胞分別和不同含藥血清培養(yǎng)，每孔加2 ml，48 h后收集HepG2細胞進行以下檢測。

1.2.3 細胞凋亡實驗 用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集HepG2細胞，室溫1 200 r/min離心3 min，去上清，加PBS重懸，用PBS將細胞潤洗2次，1 200 r/min離心5 min，使用AnnexinV-aPC/7-aAD細胞凋亡檢測試劑盒進行流式細胞術(shù)檢測。

1.2.4 Western Blot檢測 使用預(yù)冷后的PBS沖洗不同處理的HepG2細胞，加入裂解液后，于4℃下12 000 r/min離心5 min，收集上清溶液，蛋白樣品進行適當(dāng)稀釋，將BSA標(biāo)準(zhǔn)品制成蛋白濃度為1、0.8、0.6、0.4、0.2標(biāo)準(zhǔn)蛋白后，分別加入96孔板內(nèi)，使用BCA法測量溶液總蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD值計算出樣品蛋白濃度。通過沸水浴10 min使樣品蛋白變性，制備電泳膠，先先以恒壓80、120 V進行電泳分離，利用轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜， 使用5%的脫脂奶粉，室溫搖床封閉2 h，加入相應(yīng)的抗體，4℃孵育過夜，加入二抗，37℃搖床孵育2 h，使用PBST緩沖液清洗5～6次后，黑暗條件下曝光顯色，拍照保存。

2 結(jié)果

2.1 全方及其拆方組方對HepG2細胞凋亡的影響 見圖1、表1。

表1 不同含藥血清對HepG2細胞凋亡的影響

2.2 全方及其拆方組方對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 全方及其拆方組方對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白GSK-3β、p-GSK-3β、c-myc、cyclinD1、β-catenin、MMP2表達的影響見圖2，3、表2。

圖2 不同含藥血清對HepG2細胞Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

圖3 不同組含藥血清對MMP2蛋白表達的影響

3 討論

經(jīng)典Wnt信號通路與非小細胞性肺癌[4]、乳腺癌[5]、肝癌[6]等多種人類癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在細胞增殖周期、免疫周期及細胞的晝夜節(jié)律三個循環(huán)過程中起著核心作用[7]。GSK-3β是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞的結(jié)構(gòu)重塑、分裂、增殖、黏附、調(diào)控基因表達、血管生成及癌變等過程中發(fā)揮著重要作用[8]。Wnt 信號的激活可使GSK-3β磷酸化失活，進而抑制β-catenin磷酸化，使β-catenin在細胞內(nèi)累積，高表達的β-catenin 進入細胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，促進靶基因轉(zhuǎn)錄。CyclinD1作為細胞增殖的一種正性調(diào)節(jié)因子，其過量表達可加速細胞分裂；c-myc是一個核內(nèi)癌基因，具有使細胞獲得無限增殖、促進細胞分裂的功能，在腫瘤進展中起著重要的調(diào)控作用。MMP2是Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因，對肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移有促進作用。

毒痰瘀脾腎虛方由葉下珠、天葵子、黨參、白術(shù)等組成，具有解毒化痰祛瘀、補腎健脾扶正之功效。從“毒、痰、瘀、虛”四大證候要素出發(fā)，以扶正解毒、化痰祛瘀為主要治法，探究不同組方作用及影響環(huán)節(jié)的差異，對于揭示中醫(yī)藥治療肝癌的機制，評價其療效及優(yōu)化組方具有一定的參考價值。此次研究結(jié)果表明，根據(jù)“毒痰瘀虛”理論形成的中藥復(fù)方及其證候要素的拆方組方皆可明顯促進HepG2細胞凋亡、抑制Wnt/β-catenin信號通路，全方效果優(yōu)于拆方組方，且全方對Wnt/β-catenin 通路的抑制作用接近于索拉菲尼；全方、脾虛方、腎虛方、腎陽虛方對Wnt/β-catenin信號通路p-GSK-3β、c-myc、cyclinD1、β-catenin蛋白的表達抑制更為顯著，提示相比于單用解毒化痰祛瘀藥物，以此基礎(chǔ)加入補虛類藥物對HepG2細胞凋亡、Wnt/β-catenin信號通路抑制具有更明顯的效果，其中健脾藥、補腎藥并用效果優(yōu)于單用健脾藥或補腎藥,王憲波教授、李素領(lǐng)教授在肝癌治療中皆強調(diào)了健脾補中、益氣扶正的重要性[9,10]；錢英教授強調(diào)五臟兼顧，以肝脾腎為主，臨證多用疏肝健脾補腎類中藥[11]。各醫(yī)家對肝癌的辨證論治雖不盡相同，但總體都講究辨病辨證相結(jié)合，驅(qū)邪兼顧扶正，驅(qū)邪治療效果更強。

本研究基于毒痰瘀虛理論，從Wnt/β-catenin信號通路初步探討中藥復(fù)方對HepG2細胞的影響，為肝癌的中藥治療提供參考，但是中藥復(fù)方抗肝癌的作用機制尚不明確，還需后續(xù)進一步的系統(tǒng)分析和研究。