李 紅 江治霞 湯建橋 鄧玉萍

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)中西醫(yī)結(jié)合科 (湖北 武漢， 430016)

嬰兒膽汁淤積性肝病(ICH )是嬰兒肝病中就診和入院治療的首要原因[1]，也是中國兒童終末期肝病肝移植的主要 適應(yīng)癥[2]，是嬰兒期致死或致殘的重要原因 。肝臟與腸道，在胚胎階段均起源前腸，通過門靜脈相互關(guān)聯(lián)，是解剖上的“遠親”，功能上的“近鄰”。腸道菌群是調(diào)節(jié)肝臟生理、病理功能的重要參與者[3]。本研究擬通過細菌16S rRNA高通量測序，初步探索ICH患兒腸道菌群特征，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年7月至2019年7月武漢兒童醫(yī)院收治的10例ICH患兒為研究對象，并選取健康嬰兒10例作為對照。兩組兒童間的性別和年齡(88.3±39.85)vs(72.7±27.11)d均差異無統(tǒng)計學意義。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審查和批準，家長知情并簽署知情同意書。

1.2 納入排除標準 ICH的診斷標準[4,5]：①1歲以內(nèi)發(fā)?。虎谥苯幽懠t素(DBil)>17 μmol/L(1 mg/dl)；血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和(或)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)增高；③臨床伴有黃疸、糞便顏色變淺或白陶土樣便、尿色加深、肝臟質(zhì)地變硬或腫大(肋下可觸及>2.0 cm)。ICH組患兒納入標準：①符合ICH的診斷標準[4,5]；②近1個月內(nèi)未接受微生態(tài)制劑或抗生素治療。排除標準：①不符合納入標準；②其母孕期及哺乳期有長期用藥及益生菌制劑應(yīng)用史。健康對照組納入標準：①足月健康兒；②年齡1歲以內(nèi)；③體格檢查及生化指標均正常；④近期無感染性腹瀉、腸炎等病史；⑤近4周無抗生素及益生菌制劑等應(yīng)用史。健康對照組的排除標準與ICH組一致。

1.3 研究方法 將糞便標本送至天一輝遠公司進行高通量16SrRNA基因測序技術(shù)分析，其分析技術(shù)方法如下：①無菌器皿收集ICH患兒和健康兒童的新鮮糞便，分裝至滅菌凍存管后儲存到-80℃冰箱備用。②用QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒提取糞便樣本DNA。③PCR擴增及產(chǎn)物純化：標準細菌16SrRNA基因V4區(qū)的PCR擴增。引物信息：520F(5-AYTGGGYDTAAAGNG-3) 802R(5-TACNVGGGTATCTAATCC-3)。④文庫制備與庫檢：采用標準的Illumina Miseq PE250文庫構(gòu)建及測序流程。⑤測序及分析：Miseq上機測序，將所有分離的高質(zhì)量樣本序列做聚類分析，選取同源性≥97%的序列作為一個操作分類單位(OTU)。然后，以單個樣本中獲取的最低序列數(shù)作為OTU豐度的參照標準，通過QIIME2分析α多樣性。LEfSe差異分析(LEfSe)采用Python LEfSe包進行(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy)。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒糞菌Alpha多樣性分析 ICH組患兒糞菌豐度顯著低于對照組，兩組間糞菌多樣性差異無統(tǒng)計學意義，見表 1。

表1 兩組兒童糞菌 Alpha多樣性比較

2.2 兩組患兒糞菌物種構(gòu)成及豐度差異情況

2.2.1 兩組患兒糞菌門水平結(jié)構(gòu)差異 在門水平上共檢測到23個菌門，所測到的菌門中99.95%以上由變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)構(gòu)成。其中放線菌門、變形菌門和厚壁菌門是健康對照組糞群的三大主要菌門，三者共占糞菌的99.77%。變形菌門和厚壁菌門是ICH組中最具優(yōu)勢的兩大門類，其所占比例達 81.48%(見圖1 )。

圖1 兩組兒童糞菌間門水平結(jié)構(gòu)差異

2.2.2 兩組患兒糞菌屬水平結(jié)構(gòu)差異 在屬水平上共測得284個屬，前10位的菌屬為雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、巨球型菌屬(Megasphaera)、梭狀桿菌屬(Clostridium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、埃希氏菌屬(Escherichia)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)。與健康對照組兒童比較，ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬存在差異 (見圖 2) 。

圖2 兩組兒童糞菌間屬水平結(jié)構(gòu)差異

2.3 兩組患兒糞菌間LEfSe差異性分析 在糞菌門水平上，與健康對照組比較，ICH組患兒糞菌中放線菌門豐度較低，存在統(tǒng)計學差異(LDA>4，P<0.05)，見表2。在糞菌屬水平上，與健康對照組比較，ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬豐度較低，存在統(tǒng)計學差異(LDA>4，P<0.05)。而腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬豐度均較高，差異有統(tǒng)計學意義(均LDA>4，P<0.05)，見表3。

表2 兩組患兒糞菌間相對豐度較高菌門的比較 (%)

表3 兩組患兒糞菌間豐度存在顯著改變的菌屬比較 (%)

3 討論

肝臟與腸道之間通過門脈循環(huán)形成緊密的解剖、功能雙向聯(lián)通網(wǎng)絡(luò)。在ICH的發(fā)生和發(fā)展過程中，腸道菌群通過調(diào)節(jié)新陳代謝、免疫反應(yīng)、膽汁酸代謝發(fā)揮著重要的作用[6]。有研究表明[7]，腸道菌群可以直接參與到ICH的發(fā)病機制中，因此研究腸道菌群具有重要價值。

本研究采用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析兩組患兒腸道糞菌分布情況，能彌補傳統(tǒng)的微生物體外培養(yǎng)導致的敏感性差、準確率低等不足，可較全面地研究ICH患兒腸道菌群的變化。結(jié)果顯示，與健康對照組相比，ICH組患兒腸道糞菌多樣性無明顯變化，但門屬水平糞菌豐度存在不同程度改變。在門水平上，ICH組患兒糞菌中放線菌門豐度顯著降低。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門豐度增高，但差異無統(tǒng)計學意義。在屬水平上，ICH組患兒糞菌中雙歧桿菌屬豐度顯著降低，腸球菌屬、鏈球菌屬、腸桿菌屬豐度顯著增高。該結(jié)果表明ICH患兒腸腔正常優(yōu)勢菌屬(雙歧桿菌屬)受抑制，而條件致病菌屬(腸球菌屬、鏈球菌屬及腸桿菌屬)過度生長。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)定植于腸道黏膜上皮細胞表面的雙歧桿菌屬，不僅能在定植區(qū)形成物理性菌膜屏障，而且能上調(diào)上皮細胞間緊密連接蛋白的表達，發(fā)揮腸道屏障功能，從而抑制潛在致病菌過度增長。ICH患兒腸道糞菌雙歧桿菌屬豐度減少伴多種條件致病菌屬增長，存在腸道菌群失衡，這一結(jié)論與江鈴等[9]采用一代測序技術(shù)研究結(jié)論基本一致，但本研究分析了腸道菌群在門、屬不同水平的異同，所得結(jié)果相對全面準確。在成人常見的膽汁淤積型肝病原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)患者中也發(fā)現(xiàn)存在腸道菌群失衡。Rossen等[10]發(fā)現(xiàn) PSC患者腸道梭菌目豐度降低，可能通過影響膽汁酸代謝及腸道微環(huán)境參與PSC發(fā)病。Sabino等[11]發(fā)現(xiàn)PSC患者糞便腸球菌、梭菌屬及乳桿菌豐度明顯增加。Torres等[12]發(fā)現(xiàn)PSC患者Blautia及Barnesiellaceae明顯增加，主要是梭菌目發(fā)生改變。盡管與成人膽汁淤積型肝病患者腸道菌群“種和屬”層面上的研究結(jié)果存在著不同，但不可否認ICH嬰幼兒期患兒腸道菌群也發(fā)生了紊亂。研究證實腸道微生態(tài)紊亂能導致腸道致病菌釋放大量內(nèi)毒素等各種毒素，嚴重損傷腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能，誘導大量促炎細胞因子釋放，促進慢性肝病的發(fā)生發(fā)展[13]，因此調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡可能成為輔助治療ICH的新靶點 。

綜上所述，本研究通過高通量測序技術(shù)明確了ICH存在腸道菌群紊亂，表現(xiàn)為腸道菌群物種的豐度降低，有益菌大量減少，條件致病菌增多，為后期ICH微生態(tài)學研究提供了部分依據(jù)。 至于其腸道菌群中是否存在標志性差異菌種，以及調(diào)控其菌群失衡對改善臨床療效方面作用如何，有待后期進一步大樣本研究。