喻茂文 黃淑彬 陳永剛

1.四川大學華西醫(yī)院金堂醫(yī)院檢驗科 (四川 成都， 610400) 2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院輸血科

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是一種較為常見、且極具危害性的消化道惡性腫瘤，常被認為是所有惡性腫瘤中第二致命的癌癥[1]。近年來隨著診療水平的不斷提高，針對HCC的診斷、治療技術(shù)取得了巨大的進步，但HCC早期診斷率依然較低，晚期患者預后差，患者5年的生存率不足5%[2]。隨著近年來肝切除和移植技術(shù)取得了巨大進展，HCC患者的死亡率有所下降，但其復發(fā)率仍然高達60%[3]，且對常規(guī)化療不敏感，導致HCC患者的預后仍然不佳。因此，HCC的早期發(fā)現(xiàn)尤為重要。

MicroRNA(miRNA)可通過與靶基因mRNA 的3’端非編碼區(qū)(3’-UTR)結(jié)合調(diào)控靶基因的表達，是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，廣泛參與細胞的分化、增殖和凋亡[4]。最近一項研究揭示了miRNA在HCC起始和進展中的重要性[5]，表明miRNA可能會成為腫瘤診斷和治療的潛在靶標。miRNA 155(miR-155)位于21號染色體上，由B細胞整合簇轉(zhuǎn)錄而成[6]。除了參與促炎反應外，最新的證據(jù)還表明miR-155在幾種實體瘤的癌變過程中具有重要作用，包括結(jié)腸癌、乳腺癌和胰腺導管腺癌[7]。Guo等[8]報道m(xù)iR-155可以作為突變體，且炎癥環(huán)境可能是miR-155連接炎癥和癌癥的潛在機制。Xia等[9]使用了一種化學致癌作用的小鼠模型，該研究證明了miR-155表達在疾病進展中逐漸增加且記錄了肝細胞的轉(zhuǎn)化，表明miR-155異常表達可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定作用。有研究通過生物信息學預測miR-155可與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子性別決定區(qū)Y框6(SOX6)結(jié)合，研究報道SOX6作為一種抗癌基因，在肝癌中也具有抗癌作用[10]。而有關(guān)miR-155與SOX6的靶向調(diào)節(jié)在HCC中的作用及其可能機制的研究目前尚未見報道。因此，本研究通過檢測miR-155-5p在HCC中的表達情況并驗證其與SOX6的靶向性，初步探討兩者的關(guān)系及其可能的作用機制，為HCC的靶向治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集及臨床資料 收集2017年1月至2019年10月在四川大學華西醫(yī)院金堂醫(yī)院膽外科手術(shù)切除的HCC組織標本26例，及每例均勻?qū)陌┡越M織。男性15例，女性11例；年齡42～78歲，平均(56±9.3)歲；術(shù)后均經(jīng)病理結(jié)果證實均為 HCC，臨床病歷資料完整且術(shù)前患者均未行化療、放療及介入等其他相關(guān)輔助治療。腫瘤的TNM分期標準采用美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)第8版標準[11]：其中Ⅰ～Ⅱ期者16例，Ⅲ～Ⅳ期者10例；腫瘤分級標準采用Edmondson分級法：其中Ⅰ～Ⅱ級17例，Ⅲ～Ⅳ級9例。將所有標本放置-80℃冰箱冷凍保存，行實時定量PCR(qRT-PCR)實驗檢測。研究得到我院倫理委員會批準，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 細胞系 將HCC細胞系HepG2，Huh-7和Hep-3B用含10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。人肝細胞系HL-7702和HCC細胞系SMMC-7721均置于含1%青鏈霉素及10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞系均購自于中國科學院上海典藏細胞庫，并置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d進行常規(guī)換液及傳代。

1.3 主要儀器與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)液購于美國Sigma-Aldrich公司，DMEM培養(yǎng)液、TRIzol試劑盒、Lipofectamine 2000 Reagent試劑盒均購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于中國大連Takara Bio公司；Annexin V/FITC-PI凋亡試劑h盒及CCK-8細胞增殖試劑盒均購于上海碧云天生物有限公司；流式細胞儀FACS Calibur FCM購于美國BD Biosciences公司；倒置顯微鏡購于美國Nikon公司；SOX6-wt或SOX6-mut的pGL3對照熒光素酶報道基因載體購于美國Promega公司。

1.4 qRT-PCR檢測 將收集HCC患者癌組織、癌旁組織及各種腫瘤細胞按照TRIzol試劑盒說明書的提取組織或各種腫瘤細胞的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并使用SYBR green one進行定量PCR。 PCR反應如下：95℃持續(xù)30 s，60℃持續(xù)30 s，72℃持續(xù)30 s，共40個循環(huán)。miR-155-5p正向引物序列為5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3'，反向引物序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；SOX6正向引物序列為5'- GGAACGCTTCAC GAA TTTG-3'，反向引物序列為5'- CCTCTACCTCACCACATAAGC-3'。GAPDH和U6分別用作SOX6和miR-155-5p的內(nèi)參基因，進行了3次獨立的實驗。

1.5 細胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，用胰酶消化，離心后，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml接種于6孔板，待其細胞融合度達80%左右時，采用Lipofectamine 2000 Reagent試劑盒進行細胞轉(zhuǎn)染，其操作嚴格按照其說明書進行。轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細胞進行后續(xù)試驗。將HCC細胞系HepG2分為四組：用模擬物對照轉(zhuǎn)染的細胞是陰性對照組(NC)組，用miR-155-5p模擬物轉(zhuǎn)染的細胞是miR-155-5p模擬物組。與miR-155-5p模擬物和SOX-NC共轉(zhuǎn)染的細胞為miR-155-5p+NC組，而與miR-155-5p模擬物和SOX6共轉(zhuǎn)染的細胞稱為miR-155-5p+SOX6組。

1.6 HepG2細胞增殖的檢測 將不同處理組的HepG2細胞以1.5×104個/ml接種96孔板細胞培養(yǎng)板內(nèi)，用完全DMEM培養(yǎng)基于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別常規(guī)培養(yǎng)0、24、48、72、96 h，隨后采用CCK-8法檢測各組細胞活力。即每孔中加入100 μl的CCK-8試劑溶液，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，于450 nm波長處在酶標儀上測定各組細胞的OD值。 細胞的存活率(%)=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%，實驗獨立重復3次。

1.7 細胞凋亡檢測 取不同處理的對數(shù)生長期的HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，1 000 g離心3 min，收集各組細胞，并調(diào)整各組細胞密度以2×105個/ml接種到6孔培養(yǎng)板，以完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。次日棄去原培養(yǎng)液，胰酶消化并收集各組細胞，并向每個孔中加入200 μl HEPES，5 μl Annexin V/FITC和5 μl PI，于室溫下避光孵育15 min。借助FACS Calibur FCM觀察其各組細胞的凋亡情況，實驗獨立重復3次。

1.8 HepG2細胞劃痕實驗 將處于對數(shù)生長期經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepG2細胞以5×104個/ml的密度接種在6孔板中，待其融合度達90%后， p200尖端刮擦細胞，并用無血清培養(yǎng)基一式3份輕輕吹打，以含10%FBS的降低血清的培養(yǎng)基于37℃ 5% CO2培養(yǎng)行中共孵育24 h。分別在0、24和48 h處，借助Nikon顯微鏡觀察細胞在傷口邊緣附近遷移情況。通過ImageJ軟件測量由細胞遷移引起的刮擦區(qū)域大小的變化，檢測細胞的傷口愈合能力。

1.9 Transwell法檢測HepG2細胞侵襲能力測定 采用涂有Matrigel(BD Bioscience，San Jose，CA，USA)的8 μm孔transwell小室進行Transwell試驗分析。首先于下腔室中盛有500 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，隨后在每個上腔室中加入100 μl含細胞培養(yǎng)基。于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去未侵襲的細胞，并用甲醇固定侵襲的細胞。經(jīng)500 μl結(jié)晶紫染色，通過顯微鏡觀察和計數(shù)細胞的侵襲能力。

“待會兒我就告訴何東，我不怕死人。”何北挑釁地看著何西，其實他是嘴硬，他不是不怕死人，死人的事兒誰不怕？他也怕二伯上他爸爸那兒告狀，可何東就這么結(jié)了婚，他覺得自己太不仗義。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測 采用Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測HCC的潛在結(jié)合位點。借助Lipofectamine 2000試劑盒，其操作按照說明書執(zhí)行。將含有SOX6-wt或SOX6-mut的pGL3對照熒光素酶報道基因載體與miR-155-5P模擬物共轉(zhuǎn)染或控制進行HepG2細胞轉(zhuǎn)染48 h，依據(jù)其試劑盒說明書操作。裂解細胞，采用Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega，美國)測量細胞裂解物中的熒光素酶活性。實驗至少重復3次。

1.11 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布且方差齊性檢驗合格后，采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett法分析；不符合正態(tài)分布則用非參數(shù)檢驗進行分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miR-155-5p和SOX6在腫瘤組織中的表達情況 與癌旁組織相比，miR-155-5p在肝癌組織的表達明顯升高且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而SOX6的表達量較癌旁組織顯著下降(P<0.01)(圖1)。

圖1 miR-155-5p及SOX6在肝癌組織及癌旁組織中的表達情況

2.2 肝細胞癌細胞系模型篩選 與正常細胞系HL-7702相比較，miR-155-5p在各腫瘤細胞系表達量均有不同程度升高且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而SOX6 mRNA在各腫瘤細胞系表達量均出現(xiàn)不同程度下降，且HepG2 SOX6 mRNA相對表達下降最為明顯(圖2)。

圖2 miR-155-5p及SOX6在各細胞系中mRNA的表達情況

2.3 不同處理組對HepG2細胞活力及凋亡的影響 與miR-155-5p+NC組比較，SOX6過表達可有效抑制miR-155-5p促進HepG2腫瘤細胞增殖，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3)。與miR-155-5p+NC組比較，miR-155-5p+SOX6組細胞凋亡率出現(xiàn)顯著上升且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖4)。

圖3 不同處理組HepG2細胞在各時間點增殖情況

圖4 流式細胞術(shù)分析不同處理組HepG2細胞的凋亡情況

2.4 不同處理組細胞遷移及侵襲能力的分析 與miR-155-5p+NC組相比較， miR + SOX6組HepG2細胞的傷口更寬，侵襲細胞較少，表明SOX6可以減少HCC細胞的遷移和侵襲(P<0.05)(圖5，6)。

圖5 不同處理組HepG2細胞遷移率情況

2.5 miR-155-5p和SOX6的靶向性驗證 miR-155-5p和WT-SOX6-3'UTR共轉(zhuǎn)染可抑制螢光素酶活性(P<0.01)，而用Mut-SOX6-3轉(zhuǎn)染的細胞在有或沒有miR-155-5p模擬物的情況下，UTR均未表現(xiàn)出熒光素酶活性降低(圖7)。

圖7 雙熒光素酶檢測miR-155-5p與SOX6的結(jié)合情況

3 討論

肝癌的發(fā)展是一個涉及多個因素的過程。 迄今為止，該腫瘤致病機制的研究熱點主要集中在與細胞信號相關(guān)的分子變化或基因組變化領(lǐng)域。有文獻報道稱，miRNA與免疫系統(tǒng)相關(guān)的炎性疾病有關(guān)[12]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)miRNA與胰腺癌[11]、淋巴性白血病[12]等多種惡性腫瘤的發(fā)病機制密切相關(guān)。此外，Guo等[8]報道了人類原發(fā)性肝癌組織中miR-155水平的顯著增加。然而，據(jù)前期文獻查詢發(fā)現(xiàn)圍繞miR-155可能在HCC進展中發(fā)揮作用的詳細機制研究尚未見報道。有學者發(fā)現(xiàn)miR-155表達的升高與HBV感染相關(guān)的HCC患者有關(guān)。與無病肝組織中的水平相比，miR-155的表達水平在HCC腫瘤組織和鄰近的無腫瘤組織中均升高，盡管僅腫瘤組織的增加差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在觀察相鄰的肝硬化，無腫瘤組織中miR-155表達水平也升高，這表明HBV相關(guān)HCC的前期存在miR-155早期畸變[13]。在某種程度上，該結(jié)果與He等[14]報道相似，后者觀察到非腫瘤組織中的miR-155表達高于正常肝組織，且與本研究結(jié)果相一致。

眾所周知，SOX基因通過編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子SOX6參與癌細胞生物學過程的調(diào)控[15]。而SOX6作為一種抗癌基因，可以抑制多種癌癥中的細胞增殖和致瘤性[16]。目前有一些研究表明SOX6在HCC中也起著抗癌作用。例如，有研究揭示了SOX6作為HCC患者的一種新的預后生物標志物，發(fā)現(xiàn)SOX6低表達與不良預后之間的緊密聯(lián)系[17]。本研究通過HepG2細胞增值、凋亡及劃痕和Transwell試驗證實了SOX6可抑制miR-155-5p對HepG2細胞生物學行為的影響，并且通過雙熒光素酶報告驗證了miR-155-5p可靶向SOX6基因發(fā)揮其抑制肝癌細胞增殖及遷移侵襲的生物學作用。

本研究主要分析了miR-155-5p在肝癌組織及各種肝癌細胞系中的表達情況，并根據(jù)生物信息預測結(jié)果驗證了miR-155-5p與SOX6靶向性，并分析其對HepG2細胞增值及遷移的影響。由研究結(jié)果可知：與對應癌旁組織相比較，miR-155-5p的mRNA 在肝癌組織中顯著升高(P<0.01)，而肝癌組織中SOX6 mRNA的表達量較癌旁組織顯著下降(P<0.01)。通過細胞轉(zhuǎn)染miR-155-5p模擬物和SOX6 cDNA分子可獲得miR-155-5p和SOX6的過表達的細胞。由RT-qPCR結(jié)果顯示：SOX6可逆轉(zhuǎn)miR-155-5p對HepG2細胞增值及遷移侵襲。這表明miR-155-5p可抑制腫瘤抑制基因SOX6表達，并促進HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR-155-5p在HCC及HepG2細胞中高表達，可促進HepG2的增殖、遷移與侵襲，并可靶向調(diào)節(jié)SOX6基因的表達，可為HCC的早期治療提供潛在的靶點。盡管如此，本研究依然存在許多局限性，實驗結(jié)論可能存在一定的偏差。如臨床樣本不足，以及miR-155-5p的表達異常是否跟肝癌的臨床基本特征存在相關(guān)性，因此后續(xù)將會擴大樣本量、進行多中心對照研究，深入探討miR-155-5p作為HCC生物標記物的臨床應用價值。