李 碩 李小科 甘大楠 張嘉鑫 梁亦駿 葉永安△

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院脾胃病科 (北京， 100700) 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所

慢性乙型肝炎(CHB)是乙型肝炎病毒(HBV)持續(xù)感染導(dǎo)致的慢性肝臟疾病。全球約有2.57億慢性HBV感染者，每年約88.7萬人因此死亡[1]。CHB在中醫(yī)學(xué)中未明確病名，但該病具有傳染性、遷延難愈等特征，可歸為“伏邪溫病”范疇，隨病情進展亦可見于“黃疸”“臌脹”“積聚”等。若HBV慢性感染后未經(jīng)治療，40%的患者將進展為肝硬化，有發(fā)生失代償期肝硬化及肝細胞癌的風(fēng)險[1]，因此控制HBV感染，積極治療CHB尤為重要。西藥在抗病毒、阻斷肝纖維化進程方面療效確切，但仍存在耐藥變異、停藥后復(fù)發(fā)、藥物副作用大等問題。四逆散出自張仲景《傷寒論》，由柴胡、白芍、枳實、甘草四味藥物組成，其用藥精簡, 配伍嚴謹。已有多位學(xué)者通過動物實驗及臨床研究證明四逆散對治療CHB具有一定作用[2-5]，指南推薦或臨床上常用于治療CHB的逍遙散[6]、柴胡疏肝散[7]亦由四逆散化裁而來。文獻分析提示抑制HBV的核心藥物群為黃芪、白術(shù)、茯苓、甘草、柴胡、白芍、丹參、郁金、茵陳、白花蛇舌草、虎杖[8]，四逆散中三味藥物均位列其中。本課題組前期通過分析1 003例CHB(ALT≥2×ULN)患者中醫(yī)常見癥狀及證候分布特點發(fā)現(xiàn)，肝郁脾虛證在CHB患者中具有較高的發(fā)生率，為其核心病機之一[9]。四逆散為調(diào)和肝脾之要方，從病機角度為四逆散治療CHB提供了一定的支持依據(jù)。但四逆散治療CHB的具體機制仍未進一步闡明，因此，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘四逆散治療CHB的有效成分、作用靶點和信號通路，探討其功效作用網(wǎng)絡(luò)及藥效作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php，Version:2.3 )；Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch)；Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)；GeneCards(https://www.genecards.org)；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://omim.org)；PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)；String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)；Cytoscape軟件(version 3.7.1)；R軟件(x64 version 3.6.1)；R安裝包：clusterProfiler[10]。

1.2 四逆散有效化合物及對應(yīng)靶點篩選 在TCMSP平臺中檢索四逆散所含中藥(包含柴胡、白芍、枳實和甘草)，收集四逆散的有效化合物成分，設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為篩選條件，對所收集到的化合物進行篩選，并結(jié)合文獻研究及《中國藥典》2015年版中藥物的含量測定項對已篩選的化合物進行補充。

從TCMSP中檢索四逆散有效化合物對應(yīng)的靶蛋白。若化合物相關(guān)靶點未被收錄在TCMSP中，則在PubChem中檢索該化合物的Smiles結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中進行靶點預(yù)測；若化合物未被PubChem收錄或Swiss Target Prediction無法預(yù)測其相關(guān)靶點，則予以剔除。利用Uniport數(shù)據(jù)庫中的Uni Pro KBt檢索功能校正基因名稱，刪除非人源性靶點，獲得活性成分與潛在作用靶點相關(guān)信息。

1.3 慢性乙型肝炎靶點預(yù)測 使用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫以“chronic hepatitis B”為檢索關(guān)鍵詞，獲取CHB相關(guān)的靶點，合并靶點基因并去除重復(fù)基因。

1.4 藥物有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將四逆散潛在活性靶點與CHB治療靶點匹配，得到交集靶點，運用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點連接度degree值表示與某點連接的邊的數(shù)量，其值越大，該點在拓撲結(jié)構(gòu)中的重要性越高。運用Cytoscape軟件計算節(jié)點連接度degree，明確四逆散在治療CHB中較重要的有效成分及靶點。

1.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及模塊化分析 將四逆散治療CHB的靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“homo sapiens”，閾值設(shè)置為高等置信度，隱藏游離靶點，獲取蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果保存成TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件中MCODE插件進行模塊化分析，設(shè)置degree cutoff>2；K-Core設(shè)置為2，對其特征進行分析，篩選核心靶點模塊。

1.6 GO和KEGG富集分析 利用R及clusterProfiler對四逆散治療CHB的靶點進行GO和KEGG富集分析，設(shè)定閾值P<0.05，顯示富集的前20位結(jié)果，以通過基因和通路的富集分析預(yù)測四逆散治療CHB的機制。

2 結(jié)果

2.1 四逆散有效化合物篩選 依據(jù)篩選條件(OB≥30%，DL≥0.18)，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集有效成分：柴胡17個，白芍13個，枳實22個，甘草92個，根據(jù)中國藥典及文獻納入柴胡皂苷a、柴胡皂苷d。甘草酸是甘草的主要活性成分，被廣泛應(yīng)用與多種肝病的治療，甘草次酸亦具有保肝作用，故將二者納入有效成分。剔除3個未被PubChem收錄、2個Swiss Target Prediction無法預(yù)測相關(guān)靶點的化合物。最終確定化合物139個。由于結(jié)果較多，依據(jù)degree值大小，僅列出前10位較重要的有效化合物，見表1。

表1 四逆散前10位重要的有效成分

2.2 潛在作用靶點收集 在TCMSP或Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中收集有效成分靶點，運用Uniport數(shù)據(jù)庫校正潛在作用靶點基因名，去除重復(fù)基因并刪除非人源性靶點，最終得到329個四逆散潛在活性成分靶點。

2.3 CHB靶點收集 在GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫中以“chronic hepatitis B”關(guān)鍵詞進行檢索，分別檢索到8 016、454個靶點，將基因合并去重后獲得8 361個與CHB相關(guān)的靶點。

2.4 有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 四逆散潛在作用靶點與CHB靶點的交集靶點共296個，運用Cytoscape軟件構(gòu)建有效成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，圖中共包含423個節(jié)點，有效成分和靶點相互作用關(guān)系為1 840條邊。計算CHB潛在治療靶點degree值(即參與調(diào)控該靶點的化合物數(shù)量)，排名前5位的是：前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS2，degree=106.0)，雌激素受體1(ESR1，degree=85.0)，雄激素受體(AR，degree=75.0)，一氧化氮合酶亞型2(NOS2，degree=74.0)，過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG，degree=73.0)。這反映了有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖一方多靶、一靶多藥的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特點，說明四逆散采用多靶點、多路徑、多環(huán)節(jié)的方式發(fā)揮治療CHB的作用。

圖1 用Cytoscape軟件構(gòu)建四逆散的有效成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將296個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，得到TSV文件后導(dǎo)入Cytoscape軟件中繪制PPI網(wǎng)絡(luò)并進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，PPI網(wǎng)絡(luò)共包含257個節(jié)點(39個靶蛋白未參與相互作用)，1 241條連接，degree值越大，其呈現(xiàn)的圓形面積大小越大(見圖2a)；計算得到degree值中位數(shù)為7，故以degree值≥14為篩選條件，獲得四逆散治療CHB的核心靶蛋白(見圖2b)，其中STAT3(degree=32)、JUN(degree=28)、MAPK3(degree=27)、MAPK1(degree=26)等，靶蛋白degree值大，反映節(jié)點及其周邊節(jié)點的密集程度較高，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。利用Cytoscape軟件中MCODE插件對篩選出的核心靶蛋白進行模塊化分析，設(shè)置degree cutoff>2；K-Core設(shè)置為2，對其特征進行分析，篩選核心靶標模塊(見圖2c)。篩選出的模塊具有更高的信息傳遞效率，單一靶點對其他節(jié)點的相互作用更強。

a:四逆散治療CHB的靶點；b:四逆散治療CHB的核心靶蛋白;c：核心靶蛋白進行模塊化分析

2.6 GO和KEGG富集分析 將四逆散治療CHB的296個靶點進行GO功能富集分析，根據(jù)保留P<0.05的結(jié)果，進行可視化分析，列出富集結(jié)果的前20位，繪制氣泡圖(圖3)。GO功能富集分析顯示，四逆散治療CHB可能與內(nèi)肽酶活性、酰胺結(jié)合、肽結(jié)合、泛素化蛋白連接酶結(jié)合、氧化還原酶活性等生物功能相關(guān)。這表明四逆散可能通過調(diào)控HBV的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程影響CHB的發(fā)生發(fā)展。

圖3 四逆散干預(yù)CHB靶點GO富集分析

將四逆散治療CHB的靶點通過R軟件及clusterProfiler進行 KEGG富集分析，根據(jù)保留P<0.05的結(jié)果，進行可視化分析，列出富集結(jié)果的前20位，繪制氣泡圖(圖4)。結(jié)果顯示四逆散治療CHB的作用機制可能乙型肝炎、白細胞介素17(IL-17)信號通路、細胞凋亡、Toll樣受體(TLR)信號通路、Th17細胞分化等通路有關(guān)。這表明四逆散可能通過調(diào)控免疫應(yīng)答及免疫細胞分化來調(diào)控CHB進程。另外，結(jié)果提示四逆散可能參與調(diào)控人類相關(guān)致病病毒所引起的疾病通路(如人類巨細胞病毒感染、丙型肝炎、卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染)、癌癥相關(guān)通路(如胰腺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、腫瘤壞死因子信號通路)等。

圖4 四逆散干預(yù)CHB靶點KEGG富集分析

3 討論

本研究共篩選出四逆散139個主要有效成分。網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析顯示，山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、異鼠李素(isorhamnetin)、甘草次酸(enoxolone)、黃柏酮(obacunone)、柚皮素(naringenin)擁有相對較多的潛在靶點數(shù)。山柰酚可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，保護肝臟免受損傷[11]。Cheng等[12]通過在人肝癌細胞系的體外實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素可以抑制HBV抗原分泌和基因組復(fù)制，提示槲皮素可能是潛在的抗HBV藥物。一項動物實驗表明，異鼠李素可以通過P38 /PPAR-α通路抑制小鼠細胞的凋亡和自噬，從而起到保護肝臟的作用[13]。研究表明，甘草次酸通過促進其在肝細胞中的積累，增加其在細胞質(zhì)和細胞核中的分布，從而增強恩替卡韋的抗病毒效率，且不影響恩替卡韋的血漿藥代動力學(xué)[14]?？傮w而言，四逆散可能通過上述核心成分抑制HBV的復(fù)制，從而干預(yù)CHB進程，并對肝臟具有一定保護作用，可預(yù)防或延緩肝臟因反復(fù)炎癥損傷向肝纖維化、肝硬化進展。

在篩選出四逆散治療CHB的257個直接作用靶點中，STAT3與四逆散有效成分相互作用最為密切，其次是JUN、MAPK3、MAPK1等。Yang等[15]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，早期HBV感染過程中，STAT3可以促進HBV復(fù)制。在慢性HBV感染過程中，血清中HBsAg能夠結(jié)合在NK細胞表面，通過抑制STAT3信號通路活化，降低活化性受體NKp46的轉(zhuǎn)錄水平，最終導(dǎo)致NK細胞功能受到抑制[16]。Dai等[17]發(fā)現(xiàn)激活HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的p38 MAPK和JNK通路可能與促進輔助性T細胞1(Th1)分化和抗病毒免疫有關(guān)。既往體外實驗證明，MAPK1/3信號通路通過下調(diào)HNF4α參與抑制HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[18,19]。

四逆散在治療CHB過程中主要涉及的通路可能是IL-17信號通路、TLR信號通路、Th17細胞分化。IL-17是一種由Th17細胞分泌的細胞因子，在CHB患者病情進展中起到重要作用[20]。研究[21]表明，IL-17在CHB患者中明顯升高,同時IL-17與HBV DNA病毒載量呈正相關(guān)性, 且IL-17參與并激活I(lǐng)L-6/STAT3信號通路，提示IL-17參與HBV的復(fù)制和表達，抑制機體對HBV的免疫清除，導(dǎo)致CHB患者免疫系統(tǒng)功能障礙加重，從而加重肝損傷。此外，趙霞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血IL-17水平隨炎癥加重而升高，可能對肝硬化、慢加急性肝衰竭的疾病進展有促進作用。Th17細胞釋放多種炎性細胞因子，可以激活原代肝星狀細胞，進而發(fā)揮在HBV慢性感染中的致病作用[23]。TLR感知病原體相關(guān)的分子模式并激活抗病毒機制，在先天免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用。其中TLR3途徑的激活導(dǎo)致干擾素(IFN)-β的產(chǎn)生，進而在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后步驟中抑制HBV復(fù)制，TLR4信號和TLR2信號通絡(luò)激活細胞內(nèi)信號通路(如MAPK通路)，以IFN依賴性方式抑制HBV復(fù)制[24]。TLR7激動劑可以通過誘導(dǎo)I型IFN的抗病毒細胞因子來誘導(dǎo)HBV的長期抑制[25]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法系統(tǒng)預(yù)測了四逆散治療CHB的機制，通過對四逆散的有效成分、潛在靶點及靶點富集分析進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)四逆散主要通過調(diào)控免疫應(yīng)答抑制HBV復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，并能抑制炎癥反應(yīng)，保護肝臟結(jié)構(gòu)，從而在治療CHB中發(fā)揮作用。但其作用機制仍需進行大量臨床及科學(xué)研究進一步驗證，以提高臨床用藥的合理性和科學(xué)性。