陳國(guó)偉 賈嬌 杜丹 解修超 耿敬章 鄧百萬(wàn)

摘 要：對(duì)謝村黃酒酒曲中細(xì)菌進(jìn)行分離，利用薄層層析法定性、柱前衍生高效液相色譜法定量篩選出1株產(chǎn)γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric，GABA）能力的菌株N1，通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列分析鑒定，并繪制其生長(zhǎng)曲線，研究谷氨酸鈉（L-MSG）的添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響。結(jié)果表明：經(jīng)初篩得到的菌株N1，復(fù)篩測(cè)得發(fā)酵液中GABA含量為448.6 mg·L-1。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定菌株N1為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，菌株N1在液體培養(yǎng)0～4 h處于延滯期，4～12 h處于指數(shù)期，12～16 h為穩(wěn)定期，16 h之后為衰退期; 菌株N1最適培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度36℃、pH值6、接種量2%、裝液量100 mL、谷氨酸鈉添加量1%，在此條件下菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量可達(dá)583.5 mg·L-1。

關(guān)鍵詞：謝村黃酒酒曲;γ-氨基丁酸;分離鑒定;發(fā)酵特性

中圖分類號(hào)：Q 93-331? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）12-0012-07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.12.003

Isolation， Identification and Fermentation Characteristics of γ-aminobutyric acid-producing Strains

CHEN Guo-wei1， JIA Jiao1， DU Dan1，3， XIE Xiu-chao1，2*， GENG Jing-zhang1， DENG Bai-wan1，2

（1. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

2. Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicinal Fungi， Hanzhong， Shaanxi 723000， China;

3. Xianyang Academy of Agricultural Sciences， Xianyang， Shaanxi 712000， China）

Abstract： The bacteria in the yellow rice wine koji of Xiecun were isolated， and a strain N1 which was capable of producing γ-aminobutyric acid （GABA） was quantitatively screened by using the methods of thin layer chromatography and precolumn derivatization high performance liquid chromatography. The morphological observation， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence analysis and identification of the strain were carried out， and its growth curve was plotted， in order to study the effects of the addition amount of sodium glutamate （L-MSG）， fermentation time and temperature on the content of GABA produced by the strain N1. The results showed that the content of GABA in the fermentation broth was 448.6 mg·L-1 after the initial screening. Combined with the identification of morphology， physiology， biochemistry and molecular biology， the strain was identified as Bacillus subtilis. The strain was in the lag phase from 0 to 4 h after the liquid culture， the exponential phase from 4 to 12 h， the stable phase from 12 to 16 h， and the decline phase after 16 h. The optimum culture conditions for the strain N1 were as follows： fermentation time 72 h， fermentation temperature 36℃， pH value 6， inoculation amount 2%， liquid volume 100 mL， and sodium glutamate 1%. Under these conditions， the content of GABA produced by the strain N1 could reach 583.5 mg·L-1.

Key words： Yellow rice wine koji of Xiecun; γ-aminobutyric acid; Isolation and identification; Fermentation characteristics

黃酒（Huangjiu）源于中國(guó)，是世界三大釀造酒之一，被譽(yù)為“液體面包”[1-3]，具有悠久的文化歷史，是我國(guó)古代禮儀的象征[4]。謝村黃酒產(chǎn)自陜西省漢中市洋縣，起源于上古夏商時(shí)期，民間有“南有紹興加飯，北有謝村黃酒”之說(shuō)，謝村黃酒是一種具有營(yíng)養(yǎng)保健功能的發(fā)酵型低酒精度酒，2010年已被納入陜西省第一批非物質(zhì)文化遺產(chǎn)[5]。據(jù)鑒定，謝村黃酒富含17種人體必需氨基酸，總含量高達(dá)115633.66 mg·L-1，比啤酒高11倍，比紅葡萄酒高8倍，比紹興加飯酒高出1倍多[6]?！扒鸀榫浦恰盵7-8]，酒曲作為酒中產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)力源泉，其中微生物起到重要作用，微生物之間存在著共生、互生、寄生、拮抗的作用，在麥曲傳統(tǒng)制作工藝中，微生物逐漸形成一個(gè)復(fù)雜并與環(huán)境相適應(yīng)的微生物區(qū)系，決定著黃酒的品質(zhì)[9]。我國(guó)目前對(duì)黃酒研究仍然停留在生理效應(yīng)和活性物質(zhì)，對(duì)于酒曲研究主要集中于微生物產(chǎn)酶，功能活性成分γ-氨基丁酸（GABA）的研究較少，因此本研究對(duì)于黃酒中的新型功能因子GABA的研究有潛在應(yīng)用價(jià)值。

γ-氨基丁酸（GABA）是非蛋白組織氨基酸，產(chǎn)生機(jī)理是由前體物質(zhì)谷氨酸（L-glu）或谷氨酸鈉（L-MSG）經(jīng)谷氨酸脫羧酶（GAD）催化作用產(chǎn)而來(lái)，是動(dòng)物神經(jīng)中樞系統(tǒng)的主要抑制性遞質(zhì)[10]。GABA具有舒降血壓、調(diào)節(jié)抗心律失常[11-12]、抗驚厥、鎮(zhèn)痛[13-15]等功能。2009年被國(guó)家衛(wèi)生部配準(zhǔn)為新資源食品，成為研究的熱門(mén)。謝廣發(fā)等[16]研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)的古越龍山紹興黃酒中GABA含量達(dá)167～360 g·L-1;龔金炎等[17]從黃酒浸米液中篩選出產(chǎn)GABA植物乳桿菌，測(cè)得其發(fā)酵液中GABA濃度為1.02 g·L-1。本研究通過(guò)對(duì)謝村黃酒酒曲中分離的細(xì)菌，采用薄層層析法初篩定性和高效液相復(fù)篩定量，并對(duì)菌株N1進(jìn)行鑒定及其發(fā)酵特性初步研究，探討菌株N1在不同條件下的發(fā)酵能力，旨在為菌株N1用于生產(chǎn)GABA的研究提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 黃酒酒曲，由陜西秦洋長(zhǎng)生酒業(yè)有限公司提供。

1.1.2 儀器設(shè)備 電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BSA8201）、生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，SPX25085HH）、顯微鏡（上海普赫興電科技有限公司，奧林巴斯CX22）、PCR擴(kuò)增儀（上海恒久醫(yī)療器械有限公司，TA40英國(guó)Techne）、電泳儀（上海天能科技有限公司，TANOAEPS30）、高效液相色譜儀（廣東科曉分析儀器公司，Agilent HPLC1220）。1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g，pH自然，蒸餾水1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、酵母膏10.0 g、蛋白胨5.0 g、硝酸鈉3.0 g、七水硫酸鎂0.02 g、硫酸錳0.001 g、氯化鈉0.001 g、七水硫酸亞鐵0.001 g、10 g L-MSG、pH 6.0。

其他培養(yǎng)基：甲基紅試驗(yàn)培養(yǎng)基、V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基等配制方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃酒酒曲中細(xì)菌的分離 酒曲樣本放在滅菌的研缽中粉碎，37℃、140 min振蕩30 min，稀釋涂布平板，37℃恒溫培養(yǎng)。觀察并挑取單菌落多次劃線純化，純化后的平板備用，菌液于50%甘油Ep管保藏。

1.2.2 產(chǎn)GABA菌株的篩選

（1）產(chǎn)GABA菌株的初篩。薄層層析法測(cè)定見(jiàn)參考文獻(xiàn)[19] 。①發(fā)酵培養(yǎng)：以3%的接種量轉(zhuǎn)接100 mL（250 mL三角瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、140 r·min-1搖瓶振蕩發(fā)酵72 h。②發(fā)酵液處理：吸取2 mL發(fā)酵液于EP管，1000 r·min-1 4℃離心5 min，取上清液待測(cè)。③硅膠板的活化：硅膠板于烘箱105℃活化1.5 h，待用。④展開(kāi)劑擴(kuò)散層析缸：將展開(kāi)劑倒入層析缸底部1 cm，蓋上玻璃蓋，靜置1 h。⑤點(diǎn)樣、層析、顯色：以1 mg·mL-1 GABA標(biāo)準(zhǔn)液和L-MSG標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照，取10 μL發(fā)酵上清液，迅速點(diǎn)樣后吹干層析，待溶劑擴(kuò)散至硅膠板上1～2 cm處取出，立即噴顯色劑置于85℃烘箱顯色15 min。

（2）產(chǎn)GABA菌株的復(fù)篩。PITC柱前衍生化法高效液相測(cè)定參照QB/T 4356-2012《黃酒中游離氨基酸的測(cè)定 高效液相色譜法》[20]。①發(fā)酵液處理：同薄層層析法的處理方法相同，得到發(fā)酵上清液即為樣品原液。②樣品衍生化、萃取、標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生。③GABA標(biāo)品波長(zhǎng)掃描：配置不同梯度GABA標(biāo)品液，衍生化后進(jìn)行紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描，確定最終檢測(cè)波長(zhǎng)。④色譜條件：檢測(cè)波長(zhǎng)為掃描波長(zhǎng)。⑤標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。⑥測(cè)定：進(jìn)樣量10 μL，以峰面積為y軸，濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 產(chǎn)GABA菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察 觀察37℃培養(yǎng)條件下的形態(tài)特征，包括邊緣、顏色和透明度等，用革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)和大小[21]。

（2）細(xì)菌生理生化試驗(yàn) 甲基紅試驗(yàn)（M.R）、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)等參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]。

（3）分子生物學(xué)鑒定 水煮法提取細(xì)菌基因組，采用細(xì)菌通用引物1492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）擴(kuò)增目的片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，33個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果整理后提交進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 目標(biāo)菌株的特性初步研究

1.3.1 目標(biāo)菌株的生長(zhǎng)曲線 經(jīng)篩選鑒定得到的菌株為目標(biāo)菌株N1，用無(wú)菌槍頭取適量菌株N1接種于50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、140 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，每2 h測(cè)定OD600值[22]，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 發(fā)酵條件對(duì)目標(biāo)菌株產(chǎn)GABA的影響

（1）谷氨酸鈉（L-MSG）添加量對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 L-MSG是產(chǎn)生GABA的前體物質(zhì)，取活化后的菌液分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳添加量。

（2）發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液按3%的接種量接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃，140 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24、48、72、84、96 h，測(cè)定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

（3）發(fā)酵溫度對(duì)菌株發(fā)酵N1產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別置于溫度28℃、32℃、36℃、40℃、44℃條件下，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳發(fā)酵溫度。

（4）初始pH對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，初始pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳pH。

（5）裝液量對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量為25、50、100、150、200、250 mL，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳裝液量。

（6）接種量對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 將種子液接種于最優(yōu)谷氨酸鈉添加量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量為1%、2%、3%、4%、5%，140 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液GABA含量，確定最佳接種量。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒酒曲細(xì)菌分離

稀釋涂布、劃線法對(duì)黃酒酒曲樣品進(jìn)行單菌落分離，4℃平板保藏和50%甘油保藏，便于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 產(chǎn)GABA菌株N1篩選

2.2.1 產(chǎn)GABA菌株N1的初篩結(jié)果 菌株的發(fā)酵液離心后，進(jìn)行薄層層析法初篩，其中N1菌株可利用1%L-MSG生成GABA（圖1）。由圖1可知，N1菌株發(fā)酵液與標(biāo)液有一致的顯色位置，顯色較深，初步篩選出其具有產(chǎn)GABA的能力。

2.2.2 產(chǎn)GABA菌株N1的復(fù)篩結(jié)果 發(fā)酵液與標(biāo)品GABA衍生化處理后，對(duì)衍生樣品進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，確定波長(zhǎng)為254 nm，通過(guò)各濃度GABA衍生物測(cè)定結(jié)果比對(duì)分析，確定GABA保留時(shí)間為5.132 min，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3，以出峰面積為y軸，濃度為x軸，得到GABA濃度在0～80 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=12.522x-13.068（R2=0.9992），曲線有較好的線性相關(guān)關(guān)系。

通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，初篩菌株的發(fā)酵液樣品在相同時(shí)間出現(xiàn)峰值。經(jīng)計(jì)算發(fā)酵液中GABA含量為448.6 mg·L-1，將其確定為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)特性研究。

2.3 產(chǎn)GABA目標(biāo)菌株N1的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定 牛肉膏蛋白胨平板上生長(zhǎng)的菌株表面褶皺無(wú)光澤，邊緣微凸不整齊并向四周蔓延，顏色乳白色，濕潤(rùn)不透明，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為紫色短桿狀，陽(yáng)性桿菌（圖4）。

2.3.2 生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[18]對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果，并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定N1為芽孢桿菌屬，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 以菌株N1總DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增并檢測(cè)合格后送至生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司測(cè)序，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。最終鑒定菌株N1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 菌株N1生長(zhǎng)特性

由圖6可知，菌株0～4 h為延滯期，4～12 h為指數(shù)期，12～16 h為穩(wěn)定期且時(shí)間較短，16 h之后進(jìn)入衰退期，70 h后大部分菌株死亡菌體釋放，菌株在該培養(yǎng)基上有一定特異性，此后試驗(yàn)均以對(duì)數(shù)期為研究對(duì)象。

2.5 不同發(fā)酵條件對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA的影響

2.5.1 谷氨酸鈉（L-MSG）添加量對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 前體L-MSG可在谷氨酸脫羧酶存在條件下催化生產(chǎn)GABA[23]。由圖7可知，添加0～4%的L-MSG發(fā)酵液均可產(chǎn)GABA，添加量為1%時(shí)GABA濃度最高，為538 mg·L-1，超過(guò)1%時(shí)會(huì)略有下降，不添加L-MSG的空白發(fā)酵液中有少量GABA，可能與基礎(chǔ)培養(yǎng)基

成分有關(guān)。

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響微生物的代謝產(chǎn)物量。由圖8可知，發(fā)酵72 h時(shí)GABA含量最高，此后略有下降，說(shuō)明該菌株在穩(wěn)定期和衰退期會(huì)產(chǎn)生酶催化前體物質(zhì)合成GABA，故確定菌株N1的最佳發(fā)酵時(shí)間為72 h。并推測(cè)該酶為谷氨酸脫羧酶。

2.5.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 溫度是影響微生物生長(zhǎng)代謝的重要因素。由圖9可知，N1菌株最適宜的發(fā)酵溫度在 36～44℃，在此區(qū)間產(chǎn)GABA的能力較強(qiáng)，40℃時(shí)達(dá)到最大。因此，考慮后繼試驗(yàn)條件將36℃作為發(fā)酵溫度。

2.5.4 初始pH對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 初始pH不同的培養(yǎng)基會(huì)反應(yīng)菌株對(duì)酸堿度的生長(zhǎng)耐受情況。由圖10可知，在pH 5.5～6.0，GABA含量隨pH的升高而增加，pH 6.0時(shí)最高，為564 mg·L-1，之后隨pH升高而降低，由于酒曲微生物實(shí)際所處環(huán)境偏弱酸性，因此推測(cè)菌株可在弱酸性環(huán)境穩(wěn)定生產(chǎn)GABA。

2.5.5 裝液量對(duì)菌株N1發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 不同微生物對(duì)氧氣的需求量不同，對(duì)于需氧菌來(lái)說(shuō)，溶氧量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物有著直接影響。以 250 mL 三角瓶中不同裝液量來(lái)考察溶氧量對(duì)菌株N1發(fā)酵GABA的影響。由圖11可知，隨著裝液量的增加GABA含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，裝液量為100 mL時(shí)GABA含量最大，為583.5 mg·L-1，溶氧量較少時(shí)對(duì)菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致自身產(chǎn)酶較少，從而影響產(chǎn)GABA的能力。

2.5.6 接種量對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA含量的影響 接種量的多少可影響發(fā)酵液中的活菌量。由圖12可知，隨著接種量的增加發(fā)酵液中GABA含量先增加后減小，但接種量對(duì)GABA產(chǎn)量整體影響較小。因此，以2%接種量作為發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳接種量。

3 結(jié)論

GABA作為新型功能因子，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有降血壓、治療精神性疾病、促進(jìn)睡眠等多種生理功能[24-25]。羅少華等[26]利用大腸桿菌制備γ-氨基丁酸并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，但大腸桿菌會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，在安全性方面存在爭(zhēng)議?？莶菅挎邨U菌是一種發(fā)酵過(guò)程中無(wú)內(nèi)毒素產(chǎn)生的食品級(jí)微生物，獲得美國(guó)FDA資格認(rèn)證[27]，是酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌，產(chǎn)蛋白酶和糖化酶優(yōu)勢(shì)明顯并與黃酒風(fēng)味物質(zhì)密切相關(guān)[28]。因此，本研究利用枯草芽孢桿菌代謝生產(chǎn)GABA應(yīng)用于黃酒和其他發(fā)酵食品行業(yè)的思路可行，研究并利用該微生物的特性，在后期生產(chǎn)富含GABA食品中具有潛在價(jià)值。

本研究通過(guò)從謝村黃酒酒曲中分離、篩選得到的1株產(chǎn)GABA能力的菌株N1，經(jīng)初篩定性和復(fù)篩定量測(cè)得發(fā)酵液GABA含量達(dá)448.6 mg·L-1，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定確定菌株N1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）;生長(zhǎng)曲線表明該菌株在液體培養(yǎng)基0～4 h為延滯期，4～12 h為指數(shù)期，12～16 h為穩(wěn)定期，16 h之后為衰退期。發(fā)酵特性試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株N1最適發(fā)酵條件為pH 6.0、發(fā)酵溫度37℃、裝液量100 mL、發(fā)酵時(shí)間72 h，谷氨酸鈉添加量1%，接種量2%。在此條件下菌株N1發(fā)酵液產(chǎn)GABA含量為583.5 mg·L-1。本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株N1不僅能直接發(fā)酵代謝生產(chǎn)富含GABA的黃酒，還能間接發(fā)酵代謝產(chǎn)酶促進(jìn)GABA的生產(chǎn)，研究結(jié)果可為開(kāi)發(fā)富含GABA黃酒或其他功能食品提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)釀酒分技術(shù)委員會(huì).黃酒：GB/T 13662-2008[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

[2]陳玉香，葉汶坤，何冬萍，等. 酵母菌對(duì)紅曲黃酒風(fēng)味物質(zhì)形成的影響[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2015，15（7）：218-223.

[3]朱豪.廣東客家黃酒中γ-氨基丁酸的研究[D].廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2014.

[4]謝廣發(fā).黃酒釀造技術(shù)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2010.

[5]譚新喜，李夢(mèng)潔，李新生，等.謝村黃酒發(fā)展?fàn)顩r及策略研究[J].現(xiàn)代食品，2018（11）：1-4.

[6]杜丹. 謝村黃酒酒曲產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株的篩選及其應(yīng)用研究[D].漢中：陜西理工大學(xué)，2020.

[7]薛景波.黃酒接種生麥曲微生物群落結(jié)構(gòu)及分離培養(yǎng)微生物的產(chǎn)酶、產(chǎn)香性質(zhì)分析[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2016.

[8]胡文浪.黃酒工藝學(xué)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

[9]曹鈺，陳建堯，謝廣發(fā)，等. 黃酒麥曲天然發(fā)酵中真菌群落的成因初探[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008（5）：95-101.

[10]王輝，項(xiàng)麗麗，張鋒華，等. γ-氨基丁酸（GABA）的功能性及在食品中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2013，34（6）：186-189.

[11]SEGAL S A.Blockade of central nervous system GABAergic tone causes sympathetic mediated increases in coronary vasculas resistance in cats[J].Circulation Res，1984，55（3）：404-415.

[12]DUNN K，PEPPLETT-WILDMAN C M，KELLEY S P，et al.Currentperspective on the location and function of gamma-aminobutyric acid（GABA）and its metabolic partners in the kidney[J].J Nephrol Urol Res，2014，2（2）：47-57.

[13]董玲，姚英政，梁強(qiáng)，等.米糠中產(chǎn)γ-氨基丁酸細(xì)菌分離及其接種發(fā)酵研究[J].中國(guó)釀造，2018，37（1）：63-68.

[14]徐林敏.巨大芽孢桿菌X1谷氨酸脫羧酶及γ-氨基丁酸產(chǎn)條件的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[15]孫月霎，祝晉芳，馮源，等.γ-氨基丁酸與哮喘的關(guān)系[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2010（3）：40-42.

[16]謝廣發(fā)，戴軍，趙光鰲，等. 黃酒中的γ-氨基丁酸及其功能[J].中國(guó)釀造，2005（3）：49-50.

[17]龔金炎，謝湉，樓堅(jiān)，等.黃酒浸米液中產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選和鑒定[J].工業(yè)微生物，2015，45（6）：26-31.

[18]東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：162-167.

[19]邱文軍. 產(chǎn)谷氨酸脫羧酶菌株篩選及生產(chǎn)γ-氨基丁酸的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2014.

[20]全國(guó)食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心.QB/T 4356 -2012黃酒中游離氨基酸的測(cè)定高效液相色譜法[S].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2012.

[21]劉軍生，解修超，羅陽(yáng)蘭，等.抗鎘內(nèi)生細(xì)菌阿耶波多氏芽孢桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性[J].生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（2）：64-72.

[22]HEKMAT D，BAUER R，NEFF V.Optimization of the microbial synthesis of dihydroxyacetone in a semi-continuous repeated-fed-batch process byinsitu immobilization of Gluconobacter oxydans[J].Process Biochemistry，2006，42（1）：71- 76.

[23]劉婷婷，楊套偉，張術(shù)聰，等.高效轉(zhuǎn)化L-谷氨酸為γ-氨基丁酸菌株的篩選、鑒定及初步優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29（5）：742-747.

[24]JUNG-ICK B，YONG S Y，SUNG-EUN C，et al.Safety and Efficacy of Gamma-Aminobutyric Acid from Fermented Rice Germ in Patients with Insomnia Symptoms：A Randomized，Double-Blind Trial[J].Journal of Clinical Neurology，2018，14（3）：291-295.

[25]SHUKLA D K，WIJTENBURG S A，CHEN H J，et al.Anterior Cingulate Glutamate and GABA Associations on Functional Connectivity in Schizophrenia[J].Schizophrenia bulletin，2019，45（3）：647-658.

[26]羅少華，紹偉，仇敏，等.包埋-交聯(lián)法固定大腸桿菌細(xì)胞制備γ-氨基丁酸的研究[J].中國(guó)釀造，2011（11）：142-145.

[27]丁偉.谷氨酸脫羧酶重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及其發(fā)酵優(yōu)化[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2015.

[28]杜丹，解修超，李新生，等.黃酒酒曲微生物及其代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].生物資源，2019，41（2）：104-111.

（責(zé)任編輯：林玲娜）

收稿日期：2021-11-28

作者簡(jiǎn)介：陳國(guó)偉，男，1995年生，在讀碩士研究生，主要從事微生物資源保育及應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究。

通信作者：解修超，男，1982年生，博士，副教授，主要從事微生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究（E-mail：xiexiuchao@126.com）。

基金項(xiàng)目：陜西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019NY-134）;陜西省教育廳2020年服務(wù)地方專項(xiàng)科學(xué)研究計(jì)劃（20JC010）。