梁霞，李錦，伍文

結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)病率居各類惡性腫瘤發(fā)病率和病死率的第3位和第2位[1-2]，越來越多的證據(jù)表明CRC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段和多基因改變的復(fù)雜病變過程[3]；CRC早期缺乏典型的臨床癥狀和體征，大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，大多數(shù)生存期<5年，錯(cuò)失了最佳臨床治療時(shí)機(jī)，因此在臨床上應(yīng)對(duì)CRC早期診斷，積極采取早治療的臨床措施[4]。癌胚抗原(CEA)和糖蛋白抗原19-9(CA19-9)都是CRC比較常用的腫瘤標(biāo)志物，但CEA和CA19-9應(yīng)用仍存在靈敏度較低等問題[5-6]；基因甲基化是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾方式，特定基因的甲基化可作為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志[7]；多配體蛋白聚糖2(SDC2)家族是硫酸肝素蛋白聚糖中的成員，有研究證實(shí)，SDC2異常甲基化與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[8]。本研究旨在分析SDC2在結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月-2019年10月深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院/深圳大學(xué)第五附屬醫(yī)院就診治療的原發(fā)性CRC患者56例，男36例，女20例，年齡43～85(52.20±8.47)歲。所有患者均由醫(yī)院住院部術(shù)前活檢或術(shù)后病理學(xué)確診，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)第8版內(nèi)科學(xué)中結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)初次診斷為CRC；(3)不合并影響CRC的其他疾?。?4)無消化系統(tǒng)畸形；(5)無手術(shù)史；(6)未經(jīng)過任何針對(duì)腫瘤的治療；(7)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)物質(zhì)濫用或依賴者；(2)不同意參與或中途退出本研究者；(3)對(duì)本研究所用藥物過敏者；(4)各種原因引起的凝血功能障礙者；(5)妊娠患者；(6)同時(shí)合并其他腫瘤。其中把CRC患者的腫瘤組織設(shè)為A組及其癌旁正常組織設(shè)為B組，按根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)對(duì)A組進(jìn)行TNM分期分組[10]：Ⅰ期為T1亞組10例，Ⅱ期為T2亞組12例，Ⅲ期為T3亞組18例，Ⅳ期為T4亞組16例；另隨機(jī)選取同期醫(yī)院進(jìn)行健康體檢者50例作為對(duì)照組，男25例，女25例，年齡43～85(51.95±8.51)歲。各組研究對(duì)象一般臨床資料(如年齡和性別)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)，所有入組患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA的檢測(cè)：DNA抽提、反轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)均按照Trizol試劑盒說明書抽提A組結(jié)直腸癌組織、B組癌旁正常組織和對(duì)照組正常組織的SDC2甲基化DNA。采用廣州市康立明生物科技有限責(zé)任公司的SDC2甲基化DNA試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用ABI公司PRISM 7500 RT-PCR系統(tǒng)，以β-actin為內(nèi)參照檢測(cè)各組組織的SDC2甲基化DNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 CEA和CA199檢測(cè)：使用化學(xué)發(fā)光法，其檢測(cè)儀器為美國(guó)貝克曼庫爾特UniCel DxI 800型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，其配套試劑為美國(guó)貝克曼庫爾特廠家配套檢測(cè)試劑盒，詳細(xì)步驟均參照試劑說明書，將20 mg組織放置于離心管柱上，用塑料棍扭轉(zhuǎn)研磨60次，加入200 μl天然細(xì)胞裂解液(SN-002)，繼續(xù)研磨60次；開蓋冰上孵育5 min，蓋上蓋子，4 ℃，16 000×g離心15 min取出，收集管里的上清備檢。

2 結(jié) 果

2.1 各組SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表達(dá)情況 A組的SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9均高于B組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組的SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表達(dá)情況

2.2 TNM分期SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表達(dá)情況 T1、T2、T3、T4亞組中的組織中SDC2甲基化基因、CEA、CA19-9表達(dá)分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，T1、T2、T3、T4亞組中的組織中SDC2甲基化基因、CEA、CA19-9相對(duì)表達(dá)量逐漸升高。見表2。

表2 TNM分期SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9表達(dá)情況

2.3 靈敏度和特異比較 SDC2甲基化基因在CRC診斷的靈敏度和特異性均高于CEA、CA19-9及CEA聯(lián)合CA19-9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 SDC2甲基化基因、CEA和CA19-9在的靈敏度和特異性比較 (%，n=56)

3 討 論

近年來我國(guó)CRC的發(fā)病率顯著性提高，起病隱匿早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時(shí)處于中晚期，其療效差預(yù)后不良，目前CRC還未有一種腫瘤標(biāo)志物是絕對(duì)特異性的，嚴(yán)重威脅著國(guó)民的生命健康[11]。CRC的癌變及侵襲是多種因素共同作用的后果，高DNA甲基化是腫瘤抑制基因失活的重要途徑，其中DNA甲基化發(fā)揮了重要作用。因此，尋找與CRC癌變及進(jìn)展相關(guān)的DNA甲基化，并確定與之密切相關(guān)的DNA甲基化，對(duì)于CRC的診斷治療以及前期預(yù)防意義重大[12]。

CA19-9是細(xì)胞膜上的唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷脂蛋白，也屬糖類抗原；CEA是胎兒和結(jié)腸組織中的一種相對(duì)分子質(zhì)量為210K的腫瘤胚胎性抗原，基因編碼于19號(hào)染色體上的糖蛋白；CA19-9與CEA在正常健康人僅存留微量或者不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞癌變時(shí)，CA19-9與CEA可重新合成，并表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面[13]；CA19-9與CEA主要分布在從內(nèi)胚層分化而來的上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞表面，在CRC、膽管癌、胰腺癌和肺癌等組織中均表達(dá)，均是CRC輔助診斷的比較重要指標(biāo)之一。消化道惡性腫瘤患者中腫瘤組織CA19-9與CEA均高于健康正常人和癌旁正常組織[14]，這與本文研究結(jié)果一致。

SDC家族是硫酸肝素蛋白聚糖成員的I型跨膜蛋白，具有調(diào)節(jié)生命活動(dòng)中行使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子的作用，能與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)聯(lián)的多種蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)、介導(dǎo)細(xì)胞和基質(zhì)的黏附功能，SDC2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β通路的相關(guān)基因，該通路與細(xì)胞增殖、分化、遷移、血管生成和免疫監(jiān)控等生理過程的調(diào)控有關(guān)[15]。SDC2在腫瘤細(xì)胞遷移與腫瘤的血管生成均發(fā)揮重要密切關(guān)系[16]；國(guó)內(nèi)外研究者表明，多種DNA甲基化是消化道腫瘤發(fā)生的早期事件，因此特異DNA甲基化可作為消化道腫瘤早期篩查的分子標(biāo)記。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC組織中SDC2甲基化基因的表達(dá)上調(diào)，高于癌旁正常組織，并且與對(duì)照組相比有明顯差異，SDC2甲基化基因是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶第5位碳原子上，從而形成5-甲基胞嘧啶，SDC2甲基化基因在CRC中有一個(gè)獨(dú)特的子型為CpG島甲基化表型，該區(qū)甲基化在CRC中表達(dá)頻率較高，參與了多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CA19-9、CEA與SDC2甲基化基因濃度跟CRC的TNM分期有關(guān)，提示分期級(jí)別越高CA19-9、CEA與SDC2甲基化基因濃度越高，在分期中的Ⅲ期和Ⅳ期組織中表達(dá)均較高，這對(duì)CRC的TNM分期的診斷均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。SDC2基因的甲基化直接導(dǎo)致該基因功能的變化，SDC2基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯過程均發(fā)生改變，導(dǎo)致SDC2的蛋白表達(dá)的異常，使SDC2蛋白在結(jié)直腸組織中不能正常發(fā)揮作用，進(jìn)而導(dǎo)致CRC的發(fā)生，TNM分期可反映CRC的病情嚴(yán)重程度，根據(jù)該結(jié)果，我們推斷CRC的癌變及進(jìn)展可能與SDC2基因甲基化有關(guān)，SDC2甲基化基因可能參與CRC的發(fā)生及發(fā)展過程，與患者疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。但本研究中，CA19-9與CEA獨(dú)立檢測(cè)或聯(lián)合檢測(cè)CRC的靈敏度和特異度結(jié)果表明CEA和CA19-9均低于SDC2基因的甲基化的檢測(cè)，SDC2基因的甲基化的檢測(cè)可以彌補(bǔ)CEA和CA19-9對(duì)CRC輔助診斷的不足，為CRC的診斷提供了一個(gè)新的方向，探索CRC診斷潛在分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)；另外，隨著SDC2甲基化基因的廣泛應(yīng)用，臨床上不僅將SDC2甲基化基因作為CRC診斷的指標(biāo)，更重要的是用于CRC評(píng)估療效，監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)和推測(cè)預(yù)后。

綜上所述，SDC2甲基化基因在CRC組織中高表達(dá)，并且SDC2甲基化基因在診斷CRC的靈敏度和特異性均高于CEA、CA19-9及CEA聯(lián)合CA-199；SDC2甲基化基因在CRC的發(fā)生及發(fā)展等過程中均發(fā)揮一定作用，跟腫瘤血清標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)能互補(bǔ)優(yōu)勢(shì)從而提供更多有用的臨床信息，對(duì)CRC的診斷和監(jiān)測(cè)均具有臨床應(yīng)用價(jià)值。