丁平安，楊沛剛，田園，林葉成，郭洪海，劉洋，張志棟，王冬，李勇，趙群

河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院外三科，河北 石家莊 050011

目前將近20%的進展期胃癌病人在術前或術中診斷存在腹膜轉(zhuǎn)移，超過50%的T3、T4期病人在根治性切除術后發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，腹膜轉(zhuǎn)移程度越高，生存期越短[1]。相關文獻報道，腹腔游離癌細胞是胃癌腹腔播散轉(zhuǎn)移的一種早期表現(xiàn)形式，目前認為屬于晚期胃癌，現(xiàn)有的胃癌分期標準已將其明確判定為Ⅳ期[2]。研究證實腹腔內(nèi)游離癌細胞是形成腹膜轉(zhuǎn)移的先決條件，是胃癌的獨立預后不良因素[3]。腹腔內(nèi)是否存在脫落癌細胞對胃癌病人生存率有較明顯的影響，絕大多數(shù)腹腔內(nèi)存在脫落癌細胞的病人術后3年內(nèi)都死于腹膜轉(zhuǎn)移。因此在行胃癌根治術前常規(guī)進行腹腔脫落細胞學檢測，具有重要的臨床指導意義。本研究探討影響進展期胃癌病人腹腔脫落細胞學陽性的臨床病理因素，以期為臨床治療提供更精確的分期及參考依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

分析河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院2012年2月至2018年12月期間開展的一項前瞻性、多中心、開放、隨機對照Ⅲ期臨床試驗(NCT01516944)中的225例接受胃癌腹腔鏡探查并進行腹腔沖洗脫落細胞學檢查的進展期胃癌病人的臨床病理資料。該組病人年齡23～78歲(中位年齡50歲)。其中男性162例，女性63例。病人入選標準需同時滿足以下條件：(1)經(jīng)胃鏡咬檢病理組織學確診為胃癌，同時行超聲、CT等影像學檢查未發(fā)現(xiàn)遠處器官轉(zhuǎn)移、腹膜增厚及腹水；(2)無手術禁忌，能夠耐受腹腔鏡探查手術；(3)術前未接受抗腫瘤治療。所有病人均簽署知情同意書，本研究的設計與開展經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批通過(審批號：20111214029)。

二、方法

1.腹腔鏡探查方法及探查內(nèi)容[4]所有病人均于手術室在全身麻醉下行腹腔鏡探查及腹腔沖洗脫落細胞學檢查。病人取平臥位，于臍下方1.5 cm處作橫行切口，切開皮膚、皮下組織、腹白線及腹膜，置入10 mm Trocar，建立氣腹并維持壓力于12～15 mmHg 水平。置入腹腔鏡頭，直視下于右側(cè)臍鎖骨中線處置入5 mm Trocar，置入操作鉗進行探查和灌洗，探查灌洗結(jié)束后拔除Trocar，關閉戳孔，術畢。探查順序：左右膈下→肝臟、脾臟→腹腔壁層腹膜→盆腔→大網(wǎng)膜、小腸及系膜→橫結(jié)腸系膜→胃。探查內(nèi)容：(1)有無腹水；(2)腹盆腔腹膜、腸系膜、大網(wǎng)膜和Douglas腔有無轉(zhuǎn)移灶；(3)肝表面有無轉(zhuǎn)移；(4)胃周淋巴結(jié)是否腫大；(5)胃漿膜面有無浸潤；(6)胃壁是否僵硬。 對于胃體后壁腫瘤，需要切開胃結(jié)腸韌帶，探查小網(wǎng)膜囊，包括橫結(jié)腸系膜和胰腺被膜，必要時以抓鉗鉗取可疑組織進行病理學檢查。

2.腹腔沖洗脫落細胞學檢查及評估方法 (1)腹水收集：以500 mL滅菌生理鹽水分別沖洗左右膈下、腹盆腔腹膜及腸系膜，避免直接沖洗原發(fā)病灶。取頭高腳低位于Douglas腔、肝下及脾窩，收集腹腔沖洗液，離心沉渣，細胞學檢查有無脫落腫瘤細胞。(2)標本的制作：收集的沖洗液進行3 000 r/min離心10 min。沉渣溶于分離液，使用一次性病變細胞采集器，制成HE染色涂片2張用于常規(guī)診斷，同時制備8張防脫玻片涂片，置于95%乙醇中固定，用于免疫細胞化學染色。然后由有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師進行鏡檢腫瘤細胞。(3)結(jié)果的記錄：腹腔細胞學檢測結(jié)果陰性者記錄為CY0，陽性記錄為CY1。

3.腹腔脫落細胞學結(jié)果判定[5]病理科2名專業(yè)醫(yī)師閱片，胃癌腹腔脫落細胞染色的陽性結(jié)果主要有：核大深染，核漿比例失調(diào)；核染色質(zhì)致密、粗糙，分布不均，排列紊亂；核膜增厚，出現(xiàn)中斷或皺折；核仁增多等(圖1)。

4.腫瘤標志物測定方法 采集所有病人空腹狀態(tài)下的外周靜脈血5 mL，靜置0.5 h，3 000 r/min離心10 min。采用CobasE601型化學發(fā)光分析儀[羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司]以及配套試劑盒，使用電化學發(fā)光法檢測血清中癌胚抗原(CEA)、癌抗原(CA)19-9及CA72-4表達水平。各指標正常參考值：CEA≤5.0 μg/L、CA19-9≤30.0 kU/L、CA72-4≤6.9 kU/L，高于上述水平則判定為陽性。

三、統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)利用 SPSS(21.0版) 統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，將分析結(jié)果中有統(tǒng)計學意義的變量納入多因素Logistic回歸分析中，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。應用Hosmer-Lemeshow檢驗和受試者工作特征(ROC)曲線檢測模型的區(qū)分度和擬合優(yōu)度。

結(jié) 果

一、單因素分析

225例胃癌病人中發(fā)生腹腔沖洗脫落細胞學陽性(圖1)者32例，陽性率為14.22%。單因素分析顯示，病人的年齡、腫瘤直徑、浸潤深度(cT分期)、組織學類型、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(cN分期)均是影響進展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性的危險因素(均P<0.05)，詳見表1。血清中腫瘤標志物CEA、CA72-4、CA19-9表達情況亦是影響腹腔脫落細胞學陽性的危險因素(均P<0.05)，見表2。

表1 臨床病理特征與腹腔脫落細胞學陽性的單因素分析

表2 血清腫瘤標志物表達情況與腹腔脫落細胞學陽性的單因素分析

二、多因素Logistic回歸分析

結(jié)果(表3)顯示，腫瘤浸潤深度為cT4a～cT4b期以及血清中腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4的表達陽性是影響進展期胃癌病人腹腔脫落細胞學陽性的獨立危險因素(均P<0.05)。

表3 腹腔脫落細胞學陽性的多因素Logistic回歸分析

三、風險預測評分模型的建立及驗證

根據(jù)多因素Logistic回歸結(jié)果建立風險預測方程：logit (p)=-7.088+3.042×X1(腫瘤浸潤深度)+2.041×X2(CEA)+1.199×X3(CA19-9)+2.022×X4(CA72-4)，采用Hosmer-Lemeshow檢驗檢測回歸方程的擬合優(yōu)度(P=0.614)。采用ROC曲線評價回歸方程的區(qū)分度，曲線下面積為0.844[95%置信區(qū)間(0.751，0.936)，P=0.000]，見圖2。

圖1 腹腔沖洗液腺癌細胞鏡檢圖(HE染色，×400)

圖2 進展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性風險預測模型受試者工作特征(ROC)曲線

根據(jù)多因素Logistic回歸方程的回歸系數(shù)對進展期胃癌腹腔脫落細胞學陽性風險因素進行評分(表4)，建立參數(shù)模型。病人術前腫瘤浸潤深度較深(cT4a～cT4b)及血清中腫瘤標志物CEA、CA72-4、CA19-9表達陽性，其發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性風險評分分別為3、2、2、1分。評分≥4分的病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性的概率為19.44%，評分<4分的病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性的概率為4.94%。

表4 進展期胃癌病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性風險因素評分表

討 論

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，腹腔肉眼轉(zhuǎn)移病人的中位總生存期(OS)僅為3～6個月，而腹腔游離癌細胞陽性病人的總生存率同樣較差，術后5年生存率為0～18%，中位OS為10～15個月，且大多數(shù)病人均在2年內(nèi)發(fā)生腹腔腫瘤種植復發(fā)[6-10]?，F(xiàn)有文獻認為，發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移的先決條件是腹腔內(nèi)存在游離癌細胞，腹腔游離癌細胞陽性可作為Ⅳ期胃癌的獨立診斷指標，是胃癌的獨立預后不良因素[3,11-12]。因此對進展期胃癌病人在根治術前進行腹腔脫落細胞學檢查是很有必要的，能夠有效檢測出游離癌細胞，可以避免非治療性的開-關腹手術，同時可以為臨床提供更精準的治療方案。

本研究中225例進展期胃癌病人均進行腹腔鏡探查及腹腔脫落細胞學檢查，脫落細胞陽性者有32例(14.22%)，陽性率低可能與腹腔內(nèi)脫落細胞檢測方案、術中使用500 mL生理鹽水沖洗量少及沖洗范圍不足有關，不能排除假陽性與假陰性的可能。有文獻報道，腹腔灌洗液CEA測定、流式細胞術定量法、轉(zhuǎn)錄-逆轉(zhuǎn)錄協(xié)同反應法(TRC)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)等溫擴增法(RT-LAMP)等檢測技術可以有效地提高腹腔脫落細胞檢出的陽性率[13-22]。因此在以后的臨床治療中，我們將會采用更好的脫落細胞學檢測技術、使用更大劑量生理鹽水沖洗及擴大沖洗范圍來降低假陽性率及假陰性率，提高腹腔脫落細胞學陽性診斷的準確率。

在胃癌腹腔脫落細胞學陽性的相關因素分析方面，我國相關學者進行了積極的探索。宋書彬等[23]通過對163例胃癌病人臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，存在腹腔脫落細胞學陽性15例(9.20%)。單因素分析顯示，病人的病理分期、腫瘤浸潤深度、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移站別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、第2站淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率以及組織分化程度與腹腔脫落細胞學陽性有關(P<0.05)。趙樹鵬等[24]對100例胃癌病人進行回顧性分析，其中20例(20.00%)出現(xiàn)腹腔脫落細胞學陽性，單因素分析顯示腹腔脫落學陽性率與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、組織學類型有關；多因素分析顯示腹腔脫落學陽性率與腫瘤浸潤深度及組織學類型有關?？梢?，胃癌腹腔脫落細胞學的陽性率與病灶大小及浸潤范圍、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目及病理學類型密切相關。本課題組研究的225例胃癌病人，其中腹腔脫落細胞學陽性者32例，占14.22%；單因素分析發(fā)現(xiàn)，與胃癌腹腔脫落細胞學陽性有關的臨床病理因素包括病人年齡、腫瘤最大直徑、腫瘤浸潤深度、腫瘤組織學類型、腫瘤部位、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)病人年齡越趨于年輕化，發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性的概率越大，其原因可能是病人發(fā)病年齡年輕，自身代謝較為旺盛，而腫瘤組織也以更快速度發(fā)展，繼而更容易發(fā)生腹腔游離癌細胞，這與既往相關研究一致[22]。同時本研究中有2例術前T2分期病人經(jīng)腹腔鏡探查及脫落細胞學檢查后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)存在游離癌細胞，這提示在臨床診治中對于所有胃癌病人均應該進行腹腔鏡探查及腹腔脫落細胞學檢查。同時有文獻報道，CA19-9作為一種對消化道腫瘤特異性相對高的腫瘤相關抗原，與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關[25]。CA72-4 也被認為是一項上消化道腫瘤特異和敏感的診斷指標，與預后相關。同時CEA是目前最常用的腫瘤標志物之一，作為一類廣譜性腫瘤標志物，與腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關[26]。本研究中病人血清腫瘤標志物CEA、CA72-4、CA19-9表達陽性也與腹腔脫落細胞學陽性有關。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤侵犯深度深、血清中腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4的表達陽性是影響進展期胃癌病人腹腔脫落細胞學陽性的獨立危險因素。因此在臨床診治過程中，對于血清腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4表達異常增高的病人術前更應該進行腹腔鏡探查及腹腔脫落學檢查，排除腹腔內(nèi)存在游離癌細胞，避免非治療性的開-關腹手術。

同時胃癌病人一旦發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性將失去根治手術機會，因此，建立一種簡單有效的評分模型，提前預測腹腔脫落細胞學陽性發(fā)生的風險對胃癌手術病人圍術期的管理具有指導意義。本研究分析了可能與胃癌腹腔脫落細胞學陽性發(fā)生相關的多項臨床病理因素，建立風險預測方程，通過擬合優(yōu)度及ROC曲線證明模型擬合效果好，該方程具有較高診斷價值。本研究對Logistic回歸方程中4個獨立危險因素進行權重分配，對病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性的風險進行評分。進一步分析結(jié)果表明：評分≥4分的病人發(fā)生腹腔脫落細胞學陽性的概率高達19.44%，評分<4分的病人發(fā)生的概率僅為4.94%。

綜上所述，我國大部分胃癌病人就診時多處于進展期，發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移及腹腔內(nèi)脫落游離癌細胞的概率大增，因此關于胃癌腹腔脫落細胞學陽性的危險因素分析對提高病人臨床療效和遠期生存率、改善生活質(zhì)量具有重要的意義。對于術前分期評估為cT4a～cT4b期及腫瘤標志物CEA、CA19-9、CA72-4值增高的胃癌病人，更應該行腹腔鏡探查及腹腔沖洗脫落細胞學檢查。