尹雅潔，張宗杰，夏 險，汪勁松，梁運祥，胡遠(yuǎn)亮，

(1.湖北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，黃石 435002；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070)

殼寡糖是殼聚糖降解后聚合度在2～20范圍內(nèi)的低聚糖。與殼聚糖相比，它具有良好的水溶性及強(qiáng)大的生物學(xué)活性，是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑[1]。殼寡糖可作為免疫激活因子，誘導(dǎo)植物先天性免疫，合成抗菌物質(zhì)，激發(fā)植物基因防御[1-4]，增強(qiáng)植物抗病能力[5]。研究表明，在植物遭遇逆境時低分子量的殼聚糖能發(fā)揮積極作用，提高凈光合作用速率，抵抗?jié)B透物質(zhì)的合成，提高植物體抗氧化酶活性，增強(qiáng)清除自由基的能力，保護(hù)膜系統(tǒng)，增強(qiáng)植物體的自身抗性，促進(jìn)植物生長[6-9]。

受限于殼寡糖不易制備，殼寡糖對作物的影響研究較少。目前大多數(shù)研究工作都沒有說明試驗中所采用的殼聚糖或寡糖分子量。2007年，本課題組篩選出高產(chǎn)殼聚糖酶菌株，并隨后對該菌株的殼聚糖酶基因通過定點突變進(jìn)行改造，克隆至Pichiapastoris，篩選的重組子酶活力高達(dá)1 480 U/mL[10]。近年來，圍繞殼聚糖的酶解工藝做了大量研究工作，可以制備分子量2 000～3 000的殼寡糖。因此，本文以水稻幼苗為研究對象，通過噴施不同濃度的殼寡糖溶液，研究殼寡糖對水稻幼苗生長以及抗逆生理指標(biāo)的影響，以期為研究殼寡糖的功能以及穩(wěn)定水稻產(chǎn)量提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含殼聚糖酶基因工程菌株P(guān)ichiapastorisChoA141(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室)，殼聚糖(華山水產(chǎn)食品有限公司)，梗稻中花11(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室)。

1.2 殼寡糖的制備

由PichiapastorisChoA141經(jīng)50 L發(fā)酵罐，生產(chǎn)殼聚糖酶液體制劑。將液體酶制劑與殼聚糖膠體醋酸溶液以一定比例混合，控制加酶量和作用時間等，適時監(jiān)控黏度變化，定期檢測產(chǎn)物，進(jìn)行酶解制備殼寡糖。然后對產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，分級，噴霧干燥等，通過測定數(shù)均分子量，獲得粉狀、水溶分子量為2 000～3 000的殼寡糖。

1.3 試驗設(shè)計

中花11種子去殼消毒(體積分?jǐn)?shù)為75%酒精處理1 min，0.15% HgCl2處理10 min，無菌水清洗數(shù)次)，在1/2 MS[11]培養(yǎng)基上發(fā)芽。第3天，選取芽及根基本一致的種子轉(zhuǎn)移至塑料小方盒中(含已滅菌的MS培養(yǎng)基，每盒4行，每行5株，共20株)。幼苗轉(zhuǎn)移至溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30 ℃/25 ℃(晝/夜)，濕度為(75±5)%, 14 h光照/10 h黑暗，至3葉期(12 d左右)。以小方盒為單位，挑選生長條件基本一致的幼苗進(jìn)行試驗。幼苗分9組，正常生長條件對照組(CK)和8個脅迫組，其中低溫、干旱和鹽脅迫組分別使用0、5、12.5、25、50、125、250和500 mg/L的殼寡糖溶液，噴施葉面和葉背，藥劑量以欲滴為宜，每小盒5 mL，各組使用量保持一致，正常條件對照組噴施蒸餾水，葉片充分吸收溶液(2～3 h)后分別進(jìn)行脅迫處理。

低溫脅迫采用10 ℃處理，處理時間為7 d，每隔1 d，分別噴施殼寡糖溶液處理1次，第1、第3、第5和第7天結(jié)束，隨機(jī)采集葉片測定各生理活性指標(biāo)。第7 d結(jié)束終止脅迫并恢復(fù)正常溫度，24 h后采集葉片，測定生理活性指標(biāo)，72 h測定生長指標(biāo)。

干旱脅迫采用10% PEG 6000滲透模擬，鹽脅迫采用150 mmol/L NaCl。處理時間為7 d，每隔1 d，分別噴施殼寡糖溶液處理1次。第1、3、5和7 d結(jié)束，采集葉片，測定相對電導(dǎo)率。

1.4 指標(biāo)測定

生理生化指標(biāo)測定：電解質(zhì)滲漏率采用電導(dǎo)儀法[13]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴妥酸反應(yīng)法[8]；生長指標(biāo)分別測定小方盒中完整水稻植株株高及主根長度。

1.5 統(tǒng)計分析

電導(dǎo)率及MDA含量測定，每次3個重復(fù)。生長指標(biāo)測定隨機(jī)取10～20株幼苗。利用 SPSS 21進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和多重比較，差異性通過Tukey′s HSD test進(jìn)行檢測，P< 0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫殼寡糖對水稻幼苗生長及抗逆的影響

由圖1可知，在低溫脅迫條件下，隨時間的延長，電導(dǎo)率整體呈下降趨勢，尤其是施用殼寡糖更為明顯。水稻突然進(jìn)入低溫條件，未適應(yīng)環(huán)境，因此，起始相對電導(dǎo)率高。在噴施濃度為25和50 mg/L殼寡糖時，水稻相對電導(dǎo)率較低，說明施加適量濃度的殼寡糖可一定程度減少低溫對水稻的傷害。

CK：正常對照

水稻是喜溫作物，低溫下生長基本處于停滯狀態(tài)，這也是作物對于自身的保護(hù)?；謴?fù)正常溫度，水稻快速生長，24 h測定電導(dǎo)率，結(jié)果表明不同濃度處理相對電導(dǎo)率差異顯著(圖2)。統(tǒng)計分析表明，施用濃度在5、12.5、25、50和125 mg/L和正常溫度對照組，相對電導(dǎo)率處于同一個子集，濃度增加至250和500 mg/L，細(xì)胞受損嚴(yán)重，相對電導(dǎo)率顯著上升。低溫下不施用殼寡糖對照組，相對電導(dǎo)率顯著高于正常對照組和低濃度組。結(jié)果表明，適宜濃度的殼寡糖有利于提高作物的抗逆性。

CK：正常生長條件對照

因為MDA含量測定耗時較長，測定相對電導(dǎo)率表明殼寡糖濃度為5、12.5、25、50和125 mg/L時具有較好的保護(hù)作用。因此，僅測定50 mg/L濃度組MDA含量。結(jié)果表明，與正常對照相比，低溫下MDA含量上升，施用殼寡糖可以減緩MDA含量的升高(圖3)。

CK：正常對照；LT0和LT50：低溫脅迫、分別添加0和50 mg/L殼寡糖溶液

恢復(fù)生長72 h，采集植株并測定生長指標(biāo)(圖4和表1)。結(jié)果表明，與不施用殼寡糖組相比，施用濃度為5、12.5、25和50 mg/L，莖高變化顯著，其中濃度為25、50 mg/L時，上升最顯著，分別提高19.85%和24.40%；濃度在12.5、25、50、125和250 mg/L，主根顯著增長，其中濃度為25和50 mg/L時變化最大，分別提高49.50%和42.30%。

(a)脅迫結(jié)束；(b)和(c)恢復(fù)生長72 h

表1 恢復(fù)正常生長條件72 h水稻幼苗莖高和根長

2.2 干旱脅迫殼寡糖對水稻幼苗電導(dǎo)率的影響

由圖5可知，干旱脅迫第1天，與濃度為0的脅迫對照組相比，濃度為12.5和25 mg/L處理組水稻葉片相對電導(dǎo)率較高，而第3、第5、第7天則快速下降，相對電導(dǎo)率處于最低水平，結(jié)果說明低濃度的殼寡糖溶液可提高水稻對干旱環(huán)境的抵抗能力。

CK：正常對照

2.3 鹽脅迫殼寡糖對水稻幼苗電導(dǎo)率的影響

如圖6所示，與正常對照組相比，鹽脅迫水稻的相對電導(dǎo)率上升幅度大，且隨脅迫時間延長，相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)上升趨勢。這種現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是鹽脅迫導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)失衡，大量電解質(zhì)外流，細(xì)胞膜受損。施加殼寡糖溶液的濃度為25和50 mg/L時，總體上可緩解鹽脅迫對水稻幼苗的傷害。

CK：正常對照

3 討論與結(jié)論

水稻屬于喜溫作物，不適應(yīng)低溫。我國秦嶺、淮河以南地區(qū)是水稻的產(chǎn)區(qū)，占水稻種植面積的90%以上，氣候條件制約著其他地區(qū)的水稻生產(chǎn)[13]。在長江中下游水稻產(chǎn)區(qū)，早稻播種時節(jié)，“倒春寒”現(xiàn)象時有發(fā)生，導(dǎo)致秧苗受害而發(fā)育不良[14]。研究表明：冷害發(fā)生時水稻體內(nèi)丙二醛(MDA)含量上升48%，電導(dǎo)率增加0.5倍[15]。相對電導(dǎo)率可以反映植物細(xì)胞受傷害的程度，是衡量植物抗性的重要指標(biāo)之一，在測定植物抗寒、抗旱、耐鹽堿研究中被廣泛應(yīng)用[16]。本研究表明：低溫下施用適宜殼寡糖，水稻葉片相對電導(dǎo)率顯著降低，與正常條件對照組持平，同時丙二醛含量也有所降低，說明殼寡糖可以減少低溫對植株的傷害。目前，殼寡糖誘導(dǎo)水稻抗寒機(jī)制尚不完全清楚。王夢雨等[17]研究表明，與常溫對照組相比，低溫脅迫48 h進(jìn)行殼寡糖處理組小麥幼苗的丙二醛含量增幅降低，在減少28.85%，與本文的研究結(jié)果一致。

干旱和鹽害是影響水稻種植常見的非生物逆境因素[18]。本文通過測定電導(dǎo)率表明，施用殼寡糖，可以提高作物的抗旱能力，而且對提高耐鹽性有一定的效果。在干旱條件下，作物合成糖類、醇類、醛類等小分子來降低細(xì)胞滲透勢，以防胞內(nèi)水分的外滲，同時產(chǎn)生脅迫信號，啟動活性氧清除等防御系統(tǒng)，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，以提高抗旱性能[19]。研究表明：在干旱條件下，低分子量殼聚糖能促進(jìn)咖啡作物的生長，減少落果率[20]，提高草坪草的抗旱性[21]。干旱和鹽害互相影響，在干旱條件下，鹽分上返導(dǎo)致或加劇鹽害的發(fā)生[22]。鹽脅迫時，作物可能過量吸收鹽分，導(dǎo)致細(xì)胞受損，電導(dǎo)率上升，離子不平衡，破壞或降低活性氧清除劑如SOD、CAT和POD等活性，促使作物生長受到抑制或死亡[19, 23]。目前，有研究表明殼聚糖包衣處理能提高油菜[24]、水稻幼苗[25]的耐鹽性，而殼寡糖對作物耐鹽性的影響未見報道。

綜上所述，適宜濃度的殼寡糖處理可以減少水稻幼苗受到低溫、干旱和高鹽造成的傷害，特別是在提高作物抗低溫方面具有較好的效果，但其抗逆機(jī)理有待深入研究。