林曉霞，鹿 炎，李會麗，周 蘋，郭新紅，印麗萍

(1.湖南大學 生物學院 植物功能基因組學與發(fā)育調(diào)控湖南省重點實驗室, 長沙410082;2.上海市出入境檢驗檢疫局, 上海 200135)

鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo屬于蘭科(Orchidaceae)石斛屬(DendrobiumSw.)多年生草本植物，是中國古代典籍中記載最早的蘭科植物之一[1]。石斛屬是蘭科中最具藥用價值的種屬，其莖富含的氨基酸、石斛堿等成分，有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、降血糖等作用[2-5]。該屬約1 000種，中國有74種和2變種，其中細莖石斛D.moniliforme(L.)Sw.、鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo、梳唇石斛D.strongylanthumRchb.f.、美花石斛D.loddigesiiRolfe、鉤狀石斛D.aduncumLindl.等是中藥“石斛”的原植物[1]。野生的鐵皮石斛生長于海拔達1 600 m的山地半陰濕的巖石上，主要分布在中國安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部等地[6]。鐵皮石斛對于其生長環(huán)境要求比較嚴格，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環(huán)境，且不耐寒[7]。由于其生長緩慢、繁殖率低，以及人工過度開采，已被列為國家重點二級保護的珍稀瀕危植物。鐵皮石斛現(xiàn)已進入大規(guī)模人工栽培，但石斛屬植物種間形態(tài)相似，種類多，其雜交種屬也較多[8]。目前市場上鐵皮石斛的栽培品種多，種質(zhì)混雜，石斛屬藥材的質(zhì)量也參差不齊。故對鐵皮石斛的種質(zhì)資源進行分析鑒定，對維護鐵皮石斛的種質(zhì)資源具有重要意義，也為市場上鐵皮石斛的藥材質(zhì)量提供一定保障。

通過基因組特定區(qū)域有足夠變異的、易擴增且相對較短的DNA序列作為分子標記[9-11]，可以在物種水平上快速準確地鑒定物種[8-9]。該技術(shù)目前被廣泛地應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥材的分子鑒定中[12-17]。相比于藥材性狀鑒定、藥材理化鑒定等方法，通過DNA序列標記技術(shù)在鑒定藥材上不依賴于藥材性狀，重復(fù)性好且準確度高。植物葉綠體基因組通過母系遺傳給后代，結(jié)構(gòu)簡單，分子量小，序列保守，并且在不同的物種中擴增葉綠體片段的引物是通用的[7，14]，使得葉綠體基因被廣泛地用作分子標記應(yīng)用于物種鑒定及系統(tǒng)進化分析中[18]?；谌~綠體matK和rbcL基因評價藥用植物物種鑒定現(xiàn)已被應(yīng)用于許多藥用植物中[19-21]。有科學家基于基因matK或rbcL對蘭科許多科或亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行了研究[15, 22-24]，結(jié)果顯示matK和rbcL序列能很好地對蘭科植物進行鑒定。本研究采用葉綠體基因matK和rbcL序列對不同地區(qū)鐵皮石斛及已報道的屬內(nèi)近緣物種進行分析，探索石斛屬進化親緣關(guān)系，為石斛屬種質(zhì)資源鑒別、遺傳多樣性保護和遺傳育種提供重要的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

搜集中國6個省份的22份鐵皮石斛種質(zhì)資源，其中湖南省新寧縣所采集的樣品為野生品種，其余產(chǎn)地均為栽培品種，種質(zhì)編號及來源地如表1所示。樣品采自中國鐵皮石斛主要分布地，取樣時，對不同產(chǎn)地的植物隨機取2～3個植株新鮮葉片，用酒精清洗葉片表面，再用蒸餾水洗去酒精，標記好后迅速用液氮低溫冷凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 鐵皮石斛采樣地基本信息

1.2 方法

1.2.1 樣品 DNA 的提取與擴增

將收集的材料先用CTAB-free緩沖液處理，再按照植物基因組DNA提取試劑盒步驟進行DNA的提取。植物DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。將提取的DNA進行濃度和純度測定，調(diào)整最終質(zhì)量濃度為50～100 μg/μL。matK和rbcL基因擴增引物如表2[25]。其PCR擴增反應(yīng)體系為20 μL，2×Taqbuffer Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，10 nmol/L引物F 0.5 μL, 10 nmol/L引物R 0.5 μL，DNA模板1 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火 60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。

表2 PCR擴增引物

1.2.2 葉綠體基因matK和rbcL序列測定

葉綠體基因matK和rbcL序列的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1.0%瓊脂糖電泳和紫外分光光度法檢測質(zhì)量和濃度后，由湖南擎科生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行雙向測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

將獲得的測序拼接結(jié)果，通過blastn進行序列比對。運用NCBI的Taxonomy查找鐵皮石斛近緣物種的葉綠體基因matK和rbcL序列，選取了已報道的鐵皮石斛近緣物種的基因序列，將其與樣品測序的序列進行比對，利用MEGA 7.0軟件計算序列長度、GC含量、變異位點等參數(shù)。根據(jù)Kimura 2-Parameter(K2P)模型，采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用bootstrap(1 000次重復(fù))檢驗各分支的支持率。在DnaSP v5中進行多態(tài)性位點、遺傳多樣性指數(shù)和中性檢測(Fu′s Fs和Tajima′s D)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴增

成功提取了22份鐵皮石斛基因組DNA，PCR擴增基因matK和rbcL后將樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1和圖2)。22條matK序列和rbcL序列的擴增信息如表3所示。matK和rbcL序列均擴增成功，將檢測成功的樣品送測序公司進行雙向測序，校對拼接后，得到44條DNA序列。測序得到的序列長度與瓊脂糖凝膠電泳檢測的序列長度均一致。

Marker：DNA分子量標準；1～22：樣品葉綠體基因matK的目的片段，約為1 300 bp

Marker: DNA分子量標準; 1～22:樣品葉綠體基因rbcL的目的片段，約為700 bp

表3 matK和rbcL擴增序列信息

2.2 采集樣品結(jié)合已報道的葉綠體基因 matK和rbcL序列特征分析

matK序列核苷酸構(gòu)成中，AT含量為 66.8%～69.2%，GC 含量為 30.8%～33.2%，平均GC含量為32%，遠低于AT含量；當空位(gap)作為缺失處理時，序列檢測到變異位點數(shù)共929個，保守位點數(shù)768個，其中簡約信息位點871個；rbcL序列核苷酸構(gòu)成中AT堿基含量為55.6%～59.1%，GC含量為40.9%～44.4%，GC平均含量為42.9%，比AT含量略低；當空位(gap)作為缺失處理時，rbcL序列檢測到變異位點數(shù)共 506個，保守位點802個，其中簡約信息位點24個(表4)。

表4 matK和rbcL序列特征

2.3 采集樣品結(jié)合已報道的葉綠體基因matK和rbcL序列的倍型多態(tài)性分析和中性檢測

采用DnaSP 5.10[25]對matK及rbcL序列進行倍型多態(tài)性分析和中性檢測[26]。倍型多態(tài)性分析包括單倍型數(shù)量(number of haplotypes，H)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，π)、單倍型多樣性方差(variance of haplotype diversity，Vh)、單倍型多樣性標準差(standard deviation of haplotype diversity，Sh)等。結(jié)果表明：石斛屬matK序列共有H32個，Hd值0.842，π值0.270 16，Vh值0.002 56，Sh值0.051；rbcL序列共有H 17個，Hd值0.664，π值0.026 11，Vh值0.005 56，Sh值0.075。可見，石斛屬物種具有較高的遺傳多樣性。通過DnaSP 5.10 對matK及rbcL序列進行中性檢驗分析，結(jié)果表明：matK序列的Tajima′s D值、Fu and Li′s D*值、Fu and Li′s F*值檢驗均為正值，在P>0.10水平上不具有顯著性；rbcL序列的Tajima′s D值、Fu and Li′s D*值、Fu and Li′s F*值檢驗均為負值，且在P>0.10水平上具有顯著性，符合中性進化模式。結(jié)果表明從物種水平上石斛屬的rbcL序列進化模式符合中性進化的假設(shè)。

2.4 不同產(chǎn)地石斛屬葉綠體基因matK和rbcL進化分析

鐵皮石斛常用的拉丁學名有3個，分別為D.candidum、D.officinale和D.catenatum，中國植物志所用學名為D.officinale和D.candidum[1]，研究的兩個學名均有被采用；國外The Plant List網(wǎng)站(http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-57343)鐵皮石斛的拉丁學名為D.catenatum[27]。獲取已報道的鐵皮石斛近緣物種序列包括黃石斛(D.tosaense)、始興石斛(D.shixingense)、矮石斛(D.bellatulum)和玫瑰石斛(D.crepidatum)等。采用最大似然法(ML)對所有石斛屬的matK和rbcL序列進行聚類分析并構(gòu)建遺傳關(guān)系樹，如圖3和圖4，圖中紅色線為樣品所在支，藍色線為與樣品同一分支的已報道物種所在支。由圖3分析可知，matK序列構(gòu)建的ML進化樹分為兩大支，樣品序列為主要一支，已報道石斛屬物種為一支。樣品序列與已報道的D.officinale(鐵皮石斛)、D.tosaense(黃石斛)和D.acinaciforme(劍葉石斛)的matK序列為同一支，證明樣品為鐵皮石斛；除樣品編號為AHLA3和AHLA4的序列和已報道的D.officinale、D.tosaense與其他的石斛種屬處于同一支外，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛聚為一類且來自同一產(chǎn)地的居群都聚集到一起。

紅色線代表采集樣品所在分支；藍色線代表與采集樣品近緣的已報道物種的分支

紅色線代表采集樣品所在分支；藍色線代表與采集樣品近緣的已報道物種的分支

對rbcL序列構(gòu)建的ML進化樹分析表明，同樣地，不同產(chǎn)地的鐵皮石斛聚為一類且來自同一產(chǎn)地的居群都聚集到一起。樣品序列與幾個近緣物種主要分為一大支，樣品序列可以很清楚地與其他石斛屬序列分開。這一大支又再分為兩支，其中來源為江西、云南及湖南的樣品與已報道的D.officinale、D.tosaense、杓唇石斛(D.moschatum)的序列處于同一支，而來源為福建、浙江、安徽的樣品與重唇石斛(D.hercoglossum)、流蘇石斛(D.fimbriatum)、玫瑰石斛(D.crepidatum)、黃花石斛(D.catenatum)和線葉石斛(D.aurantiacum)處于一支。

3 討論

石斛屬的下級分類有13組，其中石斛組的類群莖細而花小，具有重要的藥用價值[28]。野生石斛的生長環(huán)境要求較高，且由于人工采摘過多，目前野生石斛的數(shù)量很少，基本都是通過無性繁殖方式進行人工栽培[29-30],品種較雜。本研究樣品的采集點是目前鐵皮石斛主要栽培的地方，有浙江、安徽、云南、福建、江西及湖南等6省。Asahina等[22]通過葉綠體基因matK和rbcL序列對石斛屬的5個種進行鑒定，結(jié)果顯示matK基因能很好地對其5個種進行分類，而rbcL由于其序列差異性小，所表現(xiàn)的物種鑒別能力不如matK序列。許多研究表明，rbcL具有很高的通用性，但其序列相比于其他序列保守性高，種間差異不大，用于某些物種分類鑒定的識別度不高，特別是區(qū)分中間關(guān)系密切的物種[14, 31-34]。綜合其他對蘭科植物研究所采用的基因，選擇葉綠體基因matK和rbcL序列進行鑒定。

從遺傳多樣性分析以及倍型多態(tài)性分析中，matK基因表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性(π= 0.270 16，P<0.01)，同樣在Fu′s Fs和Tajima′s D檢驗下，matK基因表現(xiàn)出更高的多樣性(π=0.026 11，P<0.001)；matK和rbcL序列Tajima′s D均顯著背離0，說明石斛屬的進化過程為自然選擇的過程。同時，在序列分析中，matK的簡約信息位點有871個，rbcL的簡約信息位點有24個，matK序列的變異遠遠大于rbcL。綜合序列分析及遺傳多樣性結(jié)果，可以得出matK序列相比rbcL序列具有更豐富的遺傳多樣性。

從利用matK所構(gòu)建的分子進化樹分析可知，所有樣品主要聚類為一大支，且與已報道的鐵皮石斛序列聚為一支，而rbcL序列所構(gòu)建的進化樹，除了已報道的鐵皮石斛還與其他的石斛屬聚為一支外，其中有杓唇石斛、重唇石斛、流蘇石斛、玫瑰石斛、黃花石斛和線葉石斛。從遺傳變異性、序列分析和系統(tǒng)進化樹三者的結(jié)果分析可以得出：matK序列的變異性相對于rbcL大，但結(jié)合兩個基因的分析可確定22個樣品屬于鐵皮石斛。兩個序列所構(gòu)建的進化樹：相同采集地的序列基本能很好地進行聚類，說明同個采集地點的鐵皮石斛種質(zhì)資源一致，樣品來源較均一；matk序列的聚類分析：安徽省的物種屬于大別山脈，其3個樣品，估計受環(huán)境影響較大，存在較大的變異；rbcL序列的聚類分析：樣品序列的一支又可分為福建、浙江、安徽一大支和江西、云南、湖南另一大支，表明福建、浙江和安徽3個省份的鐵皮石斛和江西、云南和湖南的鐵皮石斛種質(zhì)來源都較均一。其中浙江來源樣品ZJLQ6與福建的居群聚類結(jié)果更近，ZJLQ7與江西的居群更近，且都與浙江其他居群樣品距離較遠，福建、江西、浙江屬于3個毗鄰省份，說明浙江省份的部分鐵皮石斛居群可能來源于福建和江西。從rbcL序列結(jié)果可以得出，除浙江、江西外，其他省份的鐵皮石斛種質(zhì)資源首先聚在一起，表明是一自然物種。但是，來源于浙江的ZJLQ6和ZJLQ7與來源于江西的JXYT1在matK和rbcL序列的進化分析中均聚集一起，說明這3個品種的鐵皮石斛親緣關(guān)系較近，該結(jié)果與原產(chǎn)地結(jié)果劃分不完全相符；從matK序列結(jié)果可知，相同省份的鐵皮石斛居群存在一定的變異及進化，這可能與不同地區(qū)的地理環(huán)境因素或者品種來源存在一定關(guān)系。

本研究通過matK和rbcL序列，結(jié)合石斛屬序列數(shù)據(jù)，鑒定了中國6個不同鐵皮石斛群居。該研究也為石斛屬種質(zhì)資源鑒別、進化及分類研究提供了參考依據(jù)。