王 玨，胡麗麗，張育敏，吳 娜，李 睿

(山西中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，晉中 030600)

天然蛋白由于性能的局限性，在一些反應中有所限制，故須對目的蛋白進行改造，以優(yōu)化相關活性或穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的方法包括理性設計點突變及定向進化技術引入隨機突變[1-2]。這兩種技術也并不獨立，很多學者通過結合目標蛋白三級結構，對定向進化得到的隨機突變位點進行分析，可篩選出對于目的基因改造更有意義的突變位點，從而打破進化瓶頸，實現(xiàn)改造蛋白多種性能的目標[3]。

RML是源于真菌米黑霉的脂肪酶，其全基因序列包括24個氨基酸構成的信號肽，70個氨基酸組成的前導肽以及269個氨基酸組成的成熟區(qū)3部分，其中前導肽位于成熟區(qū)的N端，主要作用是幫助目標蛋白正確折疊[4]。成熟的RML可催化甘油三酯為甘油二酯，為工業(yè)油脂的改良所應用。但由于其來源于嗜溫微生物，在高壓高溫等環(huán)境中不穩(wěn)定、易失活，不利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[5]，因此，對RML熱穩(wěn)定性的改造顯得尤為重要。近年來人們也開始通過氨基酸序列突變結合蛋白結構模擬來預測突變對于蛋白熱穩(wěn)定性的影響[6]，有關RML熱穩(wěn)定性研究的最新報道是通過計算機模擬對RML成熟區(qū)(不包括前導肽)進行定點突變及二硫鍵的設計，得到的突變體半衰期比野生型提高了12.5倍(70 ℃處理下)[7]。前期工作證明，前導肽突變對RML活性有影響[8]，因此，包含前導肽的全基因進化為蛋白性能的改造拓展了基因研究范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 RML全基因序列與pET30a構建的重組質粒，命名為pET30a-pro-RML，用作第一輪定向進化中易錯PCR的模板；大腸桿菌BL21，制備感受態(tài)細胞。

1.1.2 工具酶 T4 DNA連接酶；TaqDNA聚合酶；限制性內切酶NcoI、Hind III購于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.3 試劑 細胞裂解液(用于96孔細菌培養(yǎng)板上裂解細胞釋放酶液)；酚酞指示劑(用于酸堿滴定檢測酶活指示)；Inoue轉化緩沖液(用于制備超級感受態(tài))。

1.1.4 設備與耗材 PCR儀，超聲破碎儀，堿式滴定管，蛋白純化儀，恒溫(可低溫)搖床，冷凍離心機，凝膠成像系統(tǒng)，96微孔培養(yǎng)板，質粒提取試劑盒，凝膠純化試劑盒，Quick change定點突變試劑盒等。

1.2 方法

1.2.1 易錯PCR與突變體文庫的建立 易錯PCR(體系加入Mn2+)上游引物: 5′-CGCGCCATGGTGCCAATCAAGAGACAATC-3′(包括酶切位點NcoI)；下游引物:5′-GCCGAAGCTTAAGTACAGAGGCCTGTGT-3′(包括酶切位點Hind III)。帶有隨機突變的RML全基因與pET30a進行連接轉化，獲得大量重組子。

1.2.2 RML脂肪酶突變體的誘導表達 將1.2.1轉化所得突變體文庫的單菌落逐一接于96孔培養(yǎng)板中(此板命名為母板)，于37 ℃，12～16 h培養(yǎng)后以2%的接種量將母板中的菌液對應轉接入一塊新的96孔培養(yǎng)板(此板命名為子板)。將轉接后的菌液37 ℃進行培養(yǎng)誘導(IPTG終濃度為0.1 mmol/L)。誘導4 h后，離心收集子板菌體。將子板放入-80 ℃冷凍12 h以上，取出后每個培養(yǎng)孔中加入250 μL的細胞裂解液，放置于37 ℃ 1～2 h，使菌體裂解，目標蛋白釋放在細胞裂解液中。具體方法參考文獻[9]。

1.2.3 突變體熱穩(wěn)定性的初篩 研究采用一種新型高效的用于脂肪酶高通量篩選的方法[10],該方法選擇油酸作為真實底物，通過指示劑的顏色變化，觀察酶活性高低。篩選時，先將酶液置于70 ℃保溫2 h，再進行活性鑒定。注意使用野生型酶液做對照。

1.2.4 突變體熱穩(wěn)定性的復篩 圖1為野生型RML純化前后的SDS-PAGE圖，分別在37 ℃和16 ℃下誘導，可看出低溫誘導蛋白表達量更高[11]，因此最終選擇16 ℃為每個蛋白樣品的復篩誘導條件。蛋白純化利用Ni柱與載體pET30a的蛋白標簽His-tag親和進行純化。以野生型蛋白為例，將1.2.3方法中通過高通量初篩得到的每個優(yōu)勢突變體都按照與野生型相同的誘導及純化條件進行操作。試驗采用堿滴定法測定純蛋白的比活進行復篩。酶活定義為：酶分子每分鐘催化底物(油脂)釋放出1 μmol脂肪酸的酶量為1個脂肪酶活力單位(U)，具體蛋白質比活計算公式如下：

M：蛋白標準品；1: 37 ℃誘導RML表達情況；2: 37 ℃ RML表達純化結果；3：16 ℃誘導RML表達情況；4：16 ℃ RML 表達純化結果

式中：V代表滴定反應體系(加酶液后)所消耗的NaOH溶液體積(mL)；V0代表滴定空白體系(無酶液)所消耗的NaOH溶液體積(mL)；t代表反應時間(min)；n代表酶液體積(純化后)(mL)；M代表滴定用的NaOH溶液的濃度(mmol/L)(注：研究表示蛋白催化活性單位為U/mg，即需測定蛋白濃度，換算所得)。

1.2.5 定點突變和定點飽和突變 研究采用Quick-Change定點突變試劑盒，根據(jù)RML定向進化得到的隨機突變位點，設計相關位點的定點突變和定點飽和突變，分別包括168位氨基酸定點突變，48位、67位、240位、311位以及313位氨基酸定點飽和突變。其中擴增目標突變體所需的上下游擴增引物見表1(其中311位和313位氨基酸相隔較近，故設計一對定點飽和突變引物)。

表1 用于定點突變和飽和突變的引物序列

2 結果與分析

2.1 RML基因突變結果

通過2輪易錯PCR、2次定點突變和4次定點飽和突變，共得到9株活性和耐熱性有不同程度提高的突變體，試驗設計流程如圖2和圖3所示。

①：第一輪定向進化；②：第二輪定向進化

如圖2所示，研究以野生型RML全基因為模板，進行第一輪易錯PCR定向進化，得到2株熱穩(wěn)定性有明顯提高的突變體，分別為M1：L57V/S168P和M2：D48V/V67A/T311S。將M1上的突變點S168P通過定點突變構建在突變體M2上(研究人員單獨對57位和168位突變點進行單點突變，發(fā)現(xiàn)L57V的單點突變體經(jīng)過熱處理后，幾乎不表現(xiàn)活性，故選擇放棄該突變點)，得到突變體M3：D48V/V67A/S168P/T311S；然后以M3的重組基因為模板，進行第二輪易錯PCR定向進化，得到突變體M4：D48V/V67A/S168P/F240S/T311S和M5：D48V/V67A/S168P/T311S/D313H，都表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性；之后將M4上的突變點F240S和M5出現(xiàn)的突變點D313H通過定點突變結合，得到突變體M6：D48V/V67A/S168P/F240S/T311S/D313H。

由圖3所示，從突變體M6出發(fā)，選擇兩輪定向進化出現(xiàn)的突變點進行定點飽和突變，包括兩個位于前導肽的突變點(48位和67位)，以及3個位于RML成熟區(qū)的突變點(240位、311位及313位)，分別得到突變體M7：D48V/A67D/S168P/F240ST311S/D313H，M8：D48V/V67A/S168P/S240A/T311S/D313H，M9：D48V/V67A/S168P/S240A/S311C/D313H，相對M6而言，都表現(xiàn)為更高的熱穩(wěn)定性，其中以M9最佳(168位氨基酸出現(xiàn)脯氨酸置換，根據(jù)脯氨酸的熱穩(wěn)定性效應[12],故不再對該位點進行飽和突變)。

圖3 從M6菌株出發(fā)，進行4輪定點飽和突變流程示意圖

2.2 RML突變體熱穩(wěn)定性檢測結果

將野生型RML以及蛋白突變體M1-M9放置70 ℃ 2 h進行熱處理，檢測其保留活性，同時以常溫(37 ℃)酶活做對比。檢測結果如圖4所示。研究證明，通過2輪定向進化、2次定點突變和4輪定點飽和突變，成功提高了RML的熱穩(wěn)定性，從野生型RML到突變體M9，無論是37 ℃時的酶活，還是70 ℃熱處理后的酶活，整體都呈現(xiàn)出增長的趨勢。野生型RML經(jīng)熱處理后幾乎不表現(xiàn)活性，而M9經(jīng)熱處理后，保留活性可達(1 316±31)U/mg(保留38%)。同時，RML在37 ℃下對甘油三酯的催化活力從(253±20)U/mg提高到(3 609±100)U/mg，提高了14.3倍。另一方面，M7與M4和M5相比，M7在37 ℃下的蛋白比活較前兩者高，但其熱處理后的穩(wěn)定性有所降低，這個現(xiàn)象可由Dan S.Tawfik[13]提出的“折衷(trade off)”理論來解釋，并不是所有突變體在常溫下的活性和熱處理后的活性都是相對應提高的，該學者指出很多時候定向進化中的突變是不穩(wěn)定的(Destabilizing mutations，△△G>0)，即某些突變點提高蛋白質在常溫下的比活是以降低其穩(wěn)定性為代價。因此，尋找一個常溫和熱處理后活性都能明顯提高的突變體(M9)就尤為重要。

圖4 RML野生型和9株突變體的比活及熱穩(wěn)定性變化趨勢

3 討論

3.1 突變位點氨基酸性質分析

如表2所示，突變體M1-M9的獲得過程中，共出現(xiàn)10次不同位點的突變，其中有6次突變都是趨向于向疏水性氨基酸的改變。氨基酸側鏈從極性變成非極性后與有利于為底物與酶的結合提供疏水環(huán)境，降低結合狀態(tài)的自由能，從而有利于催化反應的進行。又發(fā)現(xiàn)M7比M6熱穩(wěn)定性降低是由于67位氨基酸由疏水性丙氨酸突變?yōu)樗嵝缘奶於彼幔@一系列試驗數(shù)據(jù)說明定向進化過程中疏水性氨基酸的出現(xiàn)可能對目的蛋白形成更穩(wěn)定的“內核”結構有幫助，從而穩(wěn)定蛋白的整體結構；另一方面，酶分子的疏水性內核常常都作為其活性中心域，這也為疏水性氨基酸的出現(xiàn)可提高目的蛋白熱保留活性作出解釋。

表2 突變體 M1-M9突變位點氨基酸性質分析

3.2 突變位點氨基酸空間結構分析

圖5(a)是野生型RML的三級結構示意圖(PDB：6QPP)，其中，A點與B點之間為RML前導肽，B點和C點之間為連接區(qū)，C點和D點之間為RML成熟區(qū)的蛋白結構；圖5(b)是突變體M9的蛋白三級結構預測圖(http://swissmodel.expasy.org/)，根據(jù)基因研究范圍，該結構含有前導肽和蛋白成熟區(qū)。

數(shù)據(jù)來源：NCBI，蛋白序列號6QPP

突變體M9與野生型蛋白的結構同源性較高，因此M9仍具備野生型RML的相關性能，且可用作氨基酸突變位點的分析。M9的熱穩(wěn)定性得到了明顯提高，其基因包含6個突變位點：D48V、V67A、S168P、S240A、S311C以及D313H。使用Chimera軟件，對以上突變位點進行分析，結果見圖6。

圖6(a)顯示48位氨基酸上游是前導肽的α螺旋，48位原Asp被疏水性Val替代，可能有利于區(qū)域結構的穩(wěn)定，而疏水作用的增強，有利于α螺旋的穩(wěn)定[14]，因此該位點的突變可能幫助穩(wěn)定了前導肽的α螺旋。圖6(b)顯示67位氨基酸位于前導肽和成熟區(qū)的連接處，其下游是成熟區(qū)蛋白的第一個β折疊，該位點由Val突變?yōu)锳la，氨基酸側鏈基團更小，可能使得前導肽和成熟區(qū)相連接區(qū)域的空間位阻更小，而前導肽的主要功能是幫助與其相連的目標蛋白正確折疊表達，因此，以上兩個位點的突變可能都通過對前導肽區(qū)域的優(yōu)化而有利于RML熱穩(wěn)定性的提高。圖6(c)顯

圖6 M9突變位點分析

4 結論

研究以包含前導肽的RML全基因為研究對象，利用易錯PCR定向進化技術，定點突變，定點飽和突變相結合策略，成功提高了RML的熱穩(wěn)定性，同時，由于RML可以水解甘油三酯為甘油二酯，從而改良油脂的營養(yǎng)和性能，因此這一研究結果對工業(yè)生產(chǎn)也具有重要意義。另一方面，通過基因改造的過程發(fā)現(xiàn)，往往需要多種方法結合才能更好地設計一條“流暢的通路”以提高目的蛋白的相關性質，而對于RML前導肽和成熟區(qū)共同進化的事實也為蛋白定向進化提供了新的思路和方法。