鐘焱婷, 楊 虹

(上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點實驗室, 上海 200240)

口臭是臨床常見癥狀，在成年人中發(fā)病率約為25%[1]。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)是引起口臭的致病菌之一，它能降解含硫氨基酸生成難聞的揮發(fā)性硫化物(VSCs)[2]，更重要的是，它在口腔菌斑生物膜形成的過程中，起到橋接早晚期定植菌、為晚期定植的厭氧菌提供結(jié)合位點的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在缺乏具核梭桿菌的情況下，其他致臭菌如牙齦卟啉單胞菌等晚期定植菌黏附率顯著降低[3]。生物膜狀態(tài)的菌株抗逆性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于浮游細(xì)菌[4]。因此，具核梭桿菌形成生物膜是造成口臭的關(guān)鍵，而抑制其生物膜為緩解口臭提供了可能性。

臨床上治療口臭主要采用機(jī)械法和化學(xué)法，存在復(fù)發(fā)率高、副作用較多等問題，有待開發(fā)如益生菌生物制劑等方法。研究表明，部分益生菌，如食竇魏斯氏菌[5]、唾液鏈球菌K12[6]、乳酸乳球菌[7]能通過抑制致臭菌生長或中和 VSCs從而緩解口臭。然而，目前尚沒有益生菌作用于致臭菌生物膜的研究，而致臭菌形成生物膜是口臭不易治療的主要原因之一[8]。

近年來，如何有效抑制致病菌生物膜形成已成為研究熱點，生物膜的形成是一個動態(tài)過程，分為初始黏附、微集落形成以及生物膜的成熟與分散等3個階段，初始黏附與菌體表面蛋白、多肽、黏附素等密切相關(guān)，EPSs對微集落形成和生物膜結(jié)構(gòu)的發(fā)展至關(guān)重要[9-10]。具核梭桿菌存在多個與生物膜形成相關(guān)的外膜蛋白，其中，radD[11]、fap2[12]、aim1[13]和cmpA[14]基因編碼4個類自轉(zhuǎn)運蛋白，fomA[15]基因編碼孔蛋白，fadA[16]基因編碼黏附素，均被證實具有介導(dǎo)黏附的功能，與生物膜初始黏附相關(guān)。

本研究從多株益生菌中篩選到一株在中性 pH(pH 6.6)條件下仍能有效抑制具核梭桿菌生物膜形成的植物乳桿菌UD01，初步探究該菌株如何抑制具核梭桿菌生物膜形成，以期為益生菌用于緩解口臭提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗菌株由嘉興益諾康生物科技有限公司提供：植物乳桿菌LactobacillusplantarumZM02；唾液乳桿菌LactobacillussalivariusZM06；唾液鏈球菌StreptococcussalivariusZM252；嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilusZM236；植物乳桿菌LactobacillusplantarumUD01；唾液乳桿菌LactobacillussalivariusUD06。

具核梭桿菌(F.nucleatumATCC 25586)購自美國菌種保藏中心(ATCC)。

1.1.2 試劑

MRS 培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；TSB 培養(yǎng)基購于北京索萊寶科技有限公司；無菌脫纖維羊血購于南京茂捷微生物科技有限公司；SYTO-9染料購于賽默飛世爾科技公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購于上海生工生物股份有限公司；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit購于天根生化科技有限公司；TransScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis、TransStart Top Green qPCR SuperMix均購于北京全式金生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

1)益生菌無細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備?；罨蟮囊嫔臧?%接種量接種于MRS肉湯，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，4 ℃、500 r/min離心5 min，NaOH(1mol/L)調(diào)節(jié)上清液pH值至6.6±0.02，并用0.22 μm濾膜過濾除菌。

2)生物膜形成實驗。取100 μLF.nucleatum菌液(1×107CFU/mL)加入96孔板，再加入50 μL益生菌 CFS(pH 6.6)、50 μL TSB肉湯，以MRS肉湯(pH 6.6)作為對照。培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，200 μL PBS洗滌3次；100 μL甲醇固定15 min后，吸出甲醇，晾干；100 μL體積分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫染色5 min后，吸去結(jié)晶紫并沖洗干凈；37 ℃倒置烘干；100 μL體積分?jǐn)?shù)為33%的冰乙酸37 ℃溶解30 min；檢測OD590。

1.2.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌生物膜形成的抑制作用

1)MBIC的確定。96孔板的第1列加入100 μL UD01 CFS(pH 6.6)，以MRS(pH 6.6)肉湯作為對照；第1～5列加入100 μL TSB肉湯，倍比稀釋法將第1列液體混勻后取100 μL加入第2列，依次進(jìn)行直到第4列，第4列液體混勻后棄去100 μL；在96孔板的第1～5列中各接入100 μLF.nucleatum菌液(1×107CFU/mL)。24 h后按1.2.1節(jié)生物膜形成試驗的方法測定生物膜量。顯著抑制F.nucleatum生物膜形成的UD01 CFS(pH 6.6)的最低體積濃度為MBIC[17]。

2)生物膜結(jié)構(gòu)觀察。在24孔板中央放置直徑8 mm的蓋玻片，加入500 μL TSB肉湯、1 mLF.nucleatum菌液(1×107CFU/mL)、500 μL UD01CFS(pH 6.6、MBIC濃度)，以MRS肉湯(pH 6.6)作為對照；培養(yǎng)24 h后，PBS清洗生物膜3次；置于戊二醛(體積分?jǐn)?shù)為2.5%)中4 ℃過夜；梯度乙醇洗脫；臨界點干燥，噴金；SEM觀察。

3)生物膜厚度測定。按生物膜結(jié)構(gòu)觀察試驗的方法制取、洗滌F.nucleatum生物膜；暗室中加入200 μL SYTO-9染料，避光孵育20 min；吸去染液、PBS洗滌 1次；樣品有生物膜的一面朝下蓋在20 mm×20 mm的蓋玻片上；CLSM對生物膜Z軸方向掃描成像。

1.2.3 探究UD01上清液在中性 pH 條件下抑制具核梭桿菌生物膜形成的機(jī)制

1)生長曲線。調(diào)節(jié)TSB肉湯使其含有MBIC濃度的UD01 CFS(pH 6.6)，對照組含有等量MRS肉湯(pH 6.6)，接種F.nucleatum至菌濃度為5×106CFU/mL，37 ℃厭氧孵育，每隔2 h測菌液OD600，繪制生長曲線。

2)熒光定量PCR。按生物膜結(jié)構(gòu)觀察試驗的方法制取、洗滌F.nucleatum生物膜，用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit試劑盒提取生物膜RNA，TransScript one-step gDNA removal and cDNA synthesis試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體步驟按說明書操作。qPCR引物序列如表1，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性2 min；95 ℃ 變性15 s，55 ℃ 退火15 s，68 ℃ 延伸20 s，循環(huán)40次。以16S rRNA作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

表1 實時熒光定量反應(yīng)中的引物

3)胞外EPSs含量測定。

①熱處理法提取生物膜EPSs[18]：PBS洗滌生物膜3次，將生物膜全部吹打下來并調(diào)節(jié)至OD600為2.0±0.01的菌懸液；取1 mL菌懸液80 ℃水浴30 min；5 000 r/min離心15 min，0.22 μm濾膜過濾后即為EPSs提取液。另取30 mL 生物膜懸液，5 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀80 ℃烘干至恒重E1，每毫升F.nucleatum生物膜菌懸液干重為W1=E1/30。

②Bradford法測定胞外蛋白：按照Bradford法蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的蛋白濃度α，再根據(jù)樣品體積和干重計算生物膜胞外蛋白含量P(μg/mg)=α×1 mL/W1。

③硫酸苯酚法測定胞外多糖：配制5～120 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；取1 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或EPSs提取液加入具塞試管，以ddH2O作為空白對照；加入1 mL苯酚(體積分?jǐn)?shù)為5%)振蕩10～20 s；加入5 mL濃硫酸，沸水浴15 min后測定OD490；利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的多糖濃度β，生物膜胞外多糖含量R(μg/mg)=β×1 mL/W1。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

6株待篩選的益生菌中僅有UD01CFS(pH 6.6)對F.nucleatum生物膜的抑制效果是顯著的，故將UD01作為后續(xù)試驗菌株(表2)。

表2 益生菌上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌生物膜的抑制

2.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌生物膜形成的抑制作用

2.2.1 MBIC的確定

抑制生物膜的研究通常以藥物的MBIC水平進(jìn)行[17]，當(dāng)UD01 CFS(pH 6.6)稀釋至濃度達(dá)到25%原液，F(xiàn).nucleatum生物膜形成量顯著下降，且此濃度下對照組的生物膜形成量不受影響(圖1)，由此確定UD01 CFS(pH 6.6)對F.nucleatum生物膜的MBIC為250 μL/mL。

圖1 UD01上清液(pH 6.6)對具核梭桿菌生物膜形成的最低抑制濃度

2.2.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌生物膜結(jié)構(gòu)和厚度的影響

1)掃描電鏡試驗。對照組F.nucleatum生物膜結(jié)構(gòu)致密[圖2(b)(d)]，而試驗組結(jié)構(gòu)疏松，菌體間存在較大間隙[圖2(a)(c)]，且在制備 SEM 樣品過程中，易被水流破壞，說明 UD01 CFS(pH 6.6)導(dǎo)致其對玻片的黏附力降低。

(a)試驗組(1 000×)；(b)對照組(1 000×)；(c)試驗組(3 000×)；(d)對照組(3 000×)

2)激光共聚焦顯微鏡試驗。對照組生物膜最大厚度將近16 μm[圖3(b)]，實驗組生物膜的最大厚度僅為10 μm左右[圖3(a)]，UD01 CFS(pH 6.6)導(dǎo)致F.nucleatum生物膜變薄。

(a)試驗組；(b)對照組

2.3 UD01上清液在中性 pH條件下抑制具核梭桿菌生物膜形成的機(jī)理探究

2.3.1 UD01上清液在中性 pH條件下對具核梭桿菌生長的影響

試驗組F.nucleatum生長曲線與對照組基本一致(圖 4)，說明UD01 CFS(pH 6.6)無法抑制F.nucleatum生長。

圖4 UD01上清液在中性 pH條件下對具核梭桿菌生長曲線的影響

2.3.2 UD01上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌外膜黏附相關(guān)蛋白的影響

F.nucleatum外膜黏附相關(guān)蛋白基因表達(dá)均顯著下調(diào)，其中，cmpA基因表達(dá)下調(diào)了10 倍以上。提示UD01 CFS(pH 6.6)可能通過影響初始黏附，進(jìn)而抑制F.nucleatum生物膜形成(圖5)。

圖5 UD01上清液在中性pH條件下對具核梭桿菌黏附相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.3 UD01上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌生物膜EPSs的影響

細(xì)菌通過生長增殖過程中產(chǎn)生的EPSs將單個菌粘連成微集落，大量微集落逐漸形成生物膜結(jié)構(gòu)并不斷增厚。實驗組胞外蛋白和多糖的含量均顯著降低，推測UD01 CFS(pH 6.6)可以通過減少胞外蛋白和多糖含量來抑制F.nucleatum生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)展(圖6)。

圖6 UD01 上清液在中性 pH 條件下對具核梭桿菌生物膜EPSs含量的影響

3 討論與結(jié)論

試驗用益生菌均為乳酸菌，其生長過程中會分泌大量有機(jī)酸，目前研究證實這些酸性物質(zhì)雖然能抑制致病菌生物膜形成，然而，一旦pH值上升后作用效果不佳，如Nostro等[19]研究表明乙酸、乳酸在上調(diào)pH值后，對金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用均下降。生理學(xué)指出健康口腔pH值范圍為6.6～7.1[20]，益生菌在口腔中使用可能會受到口腔中性pH環(huán)境的影響，使得有機(jī)酸等活性物質(zhì)無法發(fā)揮作用。因此，益生菌需存在除酸以外的活性物質(zhì)，才能在口腔中發(fā)揮功效，以口腔pH值作為前提條件篩選菌株與益生菌的實際應(yīng)用更貼合。另外體外試驗中用于培養(yǎng)具核梭桿菌的 TSB 肉湯pH約7.2，為確保益生菌上清液與 TSB 肉湯混合后酸堿度在口腔中性 pH 范圍內(nèi)，將益生菌上清液 pH值調(diào)至6.6，最終篩選出一株植物乳桿菌 UD01，其上清液(pH 6.6)顯著抑制具核梭桿菌生物膜形成。

現(xiàn)階段關(guān)于抑制生物膜的機(jī)制研究，多數(shù)有效成分是通過抑菌或殺菌機(jī)制來抑制細(xì)菌生物膜的形成[21-22]，然而生長曲線顯示 UD01 CFS(pH 6.6)無法抑制具核梭桿菌生長，這與李琛等[23]發(fā)現(xiàn)右旋氨基酸在不影響牙齦卟啉單胞菌生長的同時抑制其生物膜形成的情況相類似，說明其不是通過減少具核梭桿菌數(shù)量抑制生物膜的。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)，一些活性物質(zhì)，如唾液乳桿菌[24]、槲皮素[25]，能通過下調(diào)與生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)或影響 EPSs含量來抑制變異鏈球菌或單增李斯特菌生物膜形成，結(jié)合 qPCR 和 EPSs含量測定試驗，本研究發(fā)現(xiàn)UD01 CFS(pH 6.6)既減少了具核梭桿菌生物膜胞外蛋白和多糖分泌量，又削弱了其黏附相關(guān)基因的表達(dá)水平。

本研究篩選出一株在口腔中性pH時仍能有效抑制具核梭桿菌生物膜形成的植物乳桿菌UD01，該菌株能通過下調(diào)具核梭桿菌黏附相關(guān)基因表達(dá)、降低 EPSs含量來減少具核梭桿菌生物膜形成，并使其致密度顯著疏松，厚度變薄。