李亞琳, 魏 睿, 史秀超

(渭南師范學(xué)院 環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院, 渭南 714009)

胸腺肽是胸腺組織分泌的具有生理活性的一組多肽，胸腺肽主要活性成分是由28個氨基酸組成的胸腺肽α1(Thymosin alpha 1，Tα1)。臨床上常用的Tα1是從小牛胸腺分離并經(jīng)提純的有非特異性免疫效應(yīng)的小分子多肽，它能誘導(dǎo)刺激T細(xì)胞分化和發(fā)育，維持機(jī)體免疫平衡狀態(tài)，增強(qiáng)T細(xì)胞對抗原的反應(yīng)，從而提高機(jī)體抵抗疾病的能力[1]。臨床上也有用Tα1輔助治療腫瘤如肝癌和腎母細(xì)胞瘤的報道[2-4]，然而Tα1在治療癌癥方面的研究還不是很多，其對腫瘤細(xì)胞本身的效應(yīng)也不清楚。Hela細(xì)胞源自于人類宮頸癌細(xì)胞，宮頸癌是女性較為常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在女性中居第二，僅次于乳腺癌[5]。

本研究選取注射用Tα1作為腫瘤治療試劑，以人宮頸癌Hela細(xì)胞作為研究對象。用不同濃度的Tα1處理體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，觀察其對Hela細(xì)胞生長增殖及死亡的影響，并進(jìn)一步調(diào)查Tα1誘導(dǎo)自噬相關(guān)因子lc3的表達(dá)情況，從而探索Tα1在體外誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制，為Tα1抗腫瘤研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人 Hela細(xì)胞株(購于第四軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心)；注射用Tα1(西安迪賽生物藥業(yè)有限責(zé)任公司)；反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)；定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；LC3抗體(Sigma,USA)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG；ECL發(fā)光液；蛋白提取試劑盒(碧云天)；lc3和β-actin引物由Invitrogen合成；ABI stepone plus實(shí)時熒光定量PCR儀；BHP9504-02化學(xué)發(fā)光儀。

1.2 方法

1.2.1 顯微鏡觀察細(xì)胞死亡

將處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按1×103個/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液并加入不同濃度的Tα1(10、20和30 μg/mL)作用48 h后，直接在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 MTT法檢測HeLa細(xì)胞的生長率

取對數(shù)生長期的細(xì)胞, 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×102個/mL，接種于96孔板，24 h后分別加入終濃度為：10、20、30、40、50、60和70 μg/mL 的Tα1作用24 h或48 h，同時設(shè)置正常對照組，每組6個復(fù)孔。藥物作用24 h或48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出上清液，同時每孔加入DMSO 100 μL，搖床混勻 10 min，室溫靜置 20 min 后，用酶標(biāo)儀(波長= 540 nm)測吸光值。

1.2.3 實(shí)時定量PCR檢測lc3基因的表達(dá)

Hela細(xì)胞以1×104個/mL接種于6孔板，按照上述方法用不同濃度的Tα1(10、20和30 μg/mL)處理細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞進(jìn)行RNA抽提并檢測其純度和濃度，用特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA第一鏈。用Power SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)進(jìn)行定量PCR，檢測不同濃度處理下lc3基因的表達(dá)情況，以β-actin作為內(nèi)參。lc3引物如下：正向5′-CCACACCCAAAGTCCTCACT-3′,反向5′-CACTGCTGCTTT CCGTAACA-3′,產(chǎn)物長度220 bp。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。用β-actin作為內(nèi)參來量化lc3的相對表達(dá)量。

1.2.4 Western Blot法檢測LC3的表達(dá)

不同濃度的Tα1(10、20和30 μg/mL)處理Hela細(xì)胞48 h后，用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行體積分?jǐn)?shù)為10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉(zhuǎn)膜。用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱中孵育過夜。第2天取出膜，洗凈后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶4 000), 室溫雜交1 h。加入ECL顯色，暗室曝光，顯影，定影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鏡觀察細(xì)胞死亡

在正常情況下Hela細(xì)胞呈梭形，比較飽滿，大小均一。用不同濃度(10、20和30 μg/mL)的Tα1處理后，明顯發(fā)現(xiàn)胞體變圓，細(xì)胞體積縮小，不再發(fā)生增殖等特征。并且隨著Tα1濃度的增加，細(xì)胞死亡、萎縮的程度越明顯(圖1)。

(a)Control；(b)10 μg/mL Tα1;(c)20 μg/mL Tα1;(d)30 μg/mL Tα1

2.2 MTT法檢測HeLa 細(xì)胞的死亡率

圖2和圖3是不同濃度的Tα1(10、20、30、40、50、60和70 μg/mL)處理細(xì)胞24 h和48 h后，由MTT法檢測得到的細(xì)胞OD值。與正常細(xì)胞比較，藥物處理后，測得的OD值明顯降低，并且低濃度處理組降幅更大。處理24 h后，與正常對照組比較，20 μg/mL和30 μg/mL的Tα1處理組具有顯著性差異。

圖2 Tα1處理Hela細(xì)胞24 h后MTT檢測細(xì)胞生長率

圖3 Tα1處理Hela細(xì)胞48 h后MTT檢測細(xì)胞生長率

2.3 實(shí)時定量PCR檢測lc3基因的表達(dá)

用不同濃度的Tα1處理Hela細(xì)胞48 h后，RT-PCR檢測lc3基因的表達(dá)。如圖4所示，在一定濃度范圍內(nèi)，Tα1處理后，lc3的表達(dá)明顯升高，且隨著處理濃度的增加，lc3的表達(dá)量也在升高，具有劑量依賴性。

圖4 RT-PCR檢測lc3基因的表達(dá)

2.4 Western Blot法檢測LC3的表達(dá)

不同濃度的Tα1(10、20和30 μg/mL)處理Hela細(xì)胞48 h后，Western Blot法檢測LC3蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖5所示。與Real time-PCR有一致的效應(yīng)，Tα1處理后，自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)也顯著增加，并與處理濃度呈正相關(guān)。與正常對照組比較，Tα1處理后LC3的表達(dá)具有顯著性差異。

圖5 Western Blot檢測LC3的表達(dá)

3 討論與結(jié)論

Tα1主要通過活化機(jī)體免疫細(xì)胞，增加機(jī)體免疫力來治療包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病[6]。有研究證明了Tα1也可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻止乳腺癌生長[7-8]。也有報道顯示Tα1能抑制食管鱗狀細(xì)胞癌和肺癌的發(fā)展[9-10]，所有這些報道均是通過體內(nèi)試驗(yàn)來驗(yàn)證的。在本研究中，在體外通過形態(tài)學(xué)觀察、MTT檢測、RT-PCR檢測以及Western Blot檢測調(diào)查了Tα1對Hela細(xì)胞生長增殖的抑制，并簡單分析了其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的機(jī)制，試圖揭示Tα1在體外對宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的Tα1處理Hela 細(xì)胞后，細(xì)胞均出現(xiàn)一些形態(tài)學(xué)改變，如貼壁能力下降、胞體變圓、增殖減慢或停止。這些現(xiàn)象說明Tα1能夠抑制Hela細(xì)胞的生長增殖，誘導(dǎo)其死亡。

為了進(jìn)一步探討Tα1對Hela細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)，試驗(yàn)用MTT測試法檢測了細(xì)胞的生長情況。隨著Tα1濃度的升高，測得的細(xì)胞吸光度值也逐漸減小，說明Tα1確實(shí)能夠抑制Hela細(xì)胞的增殖并殺死Hela 細(xì)胞。由圖2和圖3也可以看出，10、20和 30 μg/mL的低濃度Tα1處理對Hela的生長抑制作用更為明顯，這也是本試驗(yàn)在RT-PCR和Western Blot中所使用的Tα1濃度。MTT結(jié)果表明：Hela細(xì)胞對低濃度的藥物刺激比較敏感，而較高濃度Tα1對細(xì)胞的生長抑制作用并不是很強(qiáng)；Tα1的這種抑制作用與處理的時間呈正相關(guān)。有文章揭示了在病理?xiàng)l件下血清Tα1的水平明顯低于健康對照組[11]，這個結(jié)論或許能解釋Hela細(xì)胞對高濃度Tα1不敏感的原因。

自噬是20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)的生物現(xiàn)象，它是指細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解自身細(xì)胞器和其他大分子的過程[12]。自噬主要降解長半衰期蛋白，是細(xì)胞能夠完整降解細(xì)胞器的唯一途徑[13]，是一種由基因控制的自主性死亡過程[14]。LC3蛋白是細(xì)胞中自噬體的標(biāo)記蛋白[15]，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用RT-PCR和Western Blot檢測了自噬相關(guān)基因lc3在基因水平和蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果表明Tα1無論在哪個水平均能夠誘導(dǎo)lc3的表達(dá)，并且隨著Tα1濃度的提高，lc3的相對表達(dá)量也逐漸增加。

在腫瘤治療過程中，Tα1作為一個輔助治療因子能夠提高患者的免疫能力，但該藥物對于腫瘤細(xì)胞的作用不是很清楚。本研究僅以Hela細(xì)胞為例，證明了Tα1至少在體外對該細(xì)胞具有抑制其生長增殖的作用，并進(jìn)一步調(diào)查了Tα1通過自噬的方式誘導(dǎo)Hela細(xì)胞死亡。該結(jié)果為Tα1在腫瘤治療方面的臨床應(yīng)用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為拓寬腫瘤治療的方法提供了新的生物治療思路。