徐軼舟, 王 卓

(上海交通大學(xué)Bio-X研究院 遺傳發(fā)育與精神神經(jīng)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200030)

肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見(jiàn)的一種，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它已成為癌癥中名列前三的致死原因[1]。隨著瓦伯格效應(yīng)被揭示，人們意識(shí)到腫瘤細(xì)胞會(huì)改變自身的代謝途徑以滿足不同尋常的增殖、遷移及避免凋亡的需求[2]，因此，癌癥可以被認(rèn)為是一種復(fù)雜的代謝疾病。分析其與正常細(xì)胞內(nèi)顯著不同的生化通路，找出可能的代謝重編程位點(diǎn)，對(duì)于癌癥機(jī)制的研究有著非常重要的作用。

細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)囊括了所有生化和相關(guān)的調(diào)控反應(yīng)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，將這些反應(yīng)作為一個(gè)整體，避免了單個(gè)模塊的局限性，是代謝網(wǎng)絡(luò)模型的優(yōu)勢(shì)所在。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)的重建從酵母、大腸桿菌等模式生物，到復(fù)雜的真核生物，甚至到人都有了廣泛的應(yīng)用[3]。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)結(jié)合不同的轉(zhuǎn)錄組/蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，細(xì)胞系/組織特異性的模型也陸續(xù)被推出[4]。

有了人類(lèi)全基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型作為基礎(chǔ)，很多實(shí)驗(yàn)室將其應(yīng)用到預(yù)測(cè)各種疾病標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的工作中，其中就包括癌癥。Mardinoglu等[5]用微陣列數(shù)據(jù)挖掘出了非小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵基因。Uhlen等[6]運(yùn)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas, https://portal.gdc.cancer.gov/)中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和tINIT(Task-driven Integrative Network Inference for Tissues)算法為多種癌癥構(gòu)建了總計(jì)6 753個(gè)病人個(gè)體化代謝模型，為精準(zhǔn)分型提供基礎(chǔ)。數(shù)個(gè)基于此設(shè)計(jì)的抗癌藥物也已被FDA批準(zhǔn)并投入臨床，如針對(duì)EGFR突變導(dǎo)致的非小細(xì)胞肺癌的安維汀、治療HER2陽(yáng)性乳腺癌的帕妥珠單抗。這些結(jié)果都證明了代謝模型在癌癥研究中的可靠性，因此將代謝模型的模擬預(yù)測(cè)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，可以更高效地探索癌癥發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)研究提供可靠的理論依據(jù)。

在本文的研究中，我們對(duì)正常肝臟模型和HCC肝癌模型進(jìn)行代謝分析，通過(guò)比較兩個(gè)模型結(jié)果各異的基因，嘗試找出HCC肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝重編程位點(diǎn)，并據(jù)此探索腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的特殊機(jī)制，為臨床藥物靶點(diǎn)的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 代謝模型

采用代謝模型領(lǐng)域權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Metabolic Atlas, https://metabolicatlas.org)中的正常肝細(xì)胞[7]和HCC肝癌細(xì)胞模型[8]來(lái)進(jìn)行代謝分析。比較在敲除后對(duì)兩模型特異/共同有影響的代謝基因，探索HCC肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在重編程機(jī)制。兩個(gè)代謝模型都是以HMR2(Human Metabolic Reaction 2.0)[9]為基礎(chǔ)，通過(guò)INIT[4](Integrative Network Inference for Tissues)算法整合HPA(Human Proteome Atlas, http://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)各細(xì)胞系和組織的蛋白表達(dá)譜數(shù)據(jù)，將biomass作為衡量細(xì)胞生長(zhǎng)情況的指標(biāo)。兩個(gè)模型的組分構(gòu)成如表1所示，它們共有的基因?yàn)? 458個(gè)。

表1 代謝模型組分構(gòu)成

1.2 分析方法

代謝網(wǎng)絡(luò)的研究方法可以分為靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，然而由于缺少動(dòng)力學(xué)參數(shù)的先驗(yàn)知識(shí)，目前的算法強(qiáng)度也無(wú)法支撐在大范圍生物系統(tǒng)中如此大量數(shù)據(jù)的處理，因此動(dòng)態(tài)法的應(yīng)用十分受限，靜態(tài)法仍是目前的主流。在靜態(tài)算法中，流平衡分析法[10](Flux balance analysis, FBA)利用了基于約束的思想：假設(shè)代謝網(wǎng)絡(luò)處于穩(wěn)定態(tài)，即任何一個(gè)物質(zhì)的產(chǎn)出等于消耗。在給定閾值的凸空間內(nèi)(限制某些反應(yīng)的流值上下限，如限制營(yíng)養(yǎng)攝取反應(yīng)的流值)通過(guò)線性規(guī)劃尋找目標(biāo)函數(shù)最優(yōu)解，并以此計(jì)算此時(shí)整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的流值分布。因?yàn)镕BA的穩(wěn)態(tài)假設(shè)與生物體內(nèi)情況相符，且線性規(guī)劃的解空間穩(wěn)定性較高，因此在代謝網(wǎng)絡(luò)研究領(lǐng)域中應(yīng)用時(shí)間最長(zhǎng)，范圍也最廣。

本文主要用到了依附于MATLAB平臺(tái)的工具包COBRA[11]和RAVEN[12]，它們都是基于約束的代謝模型進(jìn)行重構(gòu)和分析的工具包。將細(xì)胞生長(zhǎng)設(shè)為目標(biāo)函數(shù)進(jìn)行求解，即可得到在當(dāng)前條件下細(xì)胞生長(zhǎng)最優(yōu)時(shí)其他反應(yīng)及其酶的狀態(tài)。

通過(guò)RAVEN工具包讀入模型，完成相應(yīng)的格式轉(zhuǎn)變，并將生成biomss的反應(yīng)設(shè)置為目標(biāo)函數(shù)；之后將COBRA工具包的數(shù)學(xué)計(jì)算器改為性能更優(yōu)的Gurobi(https://www.gurobi.com/)，并運(yùn)行singleGeneDeletion函數(shù)和doubleGeneDeletion函數(shù)對(duì)兩個(gè)模型共有的1 458個(gè)基因進(jìn)行單/雙基因敲除模擬，參數(shù)選擇默認(rèn)的線性規(guī)劃(LP)進(jìn)行求解。這兩個(gè)函數(shù)的原理是分別將待敲除基因催化的反應(yīng)流值置為0，并在滿足FBA約束條件下,依據(jù)各反應(yīng)間的承接關(guān)系重新計(jì)算目標(biāo)函數(shù)的值。

選取biomass的合成反應(yīng)作為目標(biāo)函數(shù)，以此衡量細(xì)胞生長(zhǎng)，并對(duì)敲除后會(huì)使biomass合成量降為0(即導(dǎo)致細(xì)胞死亡)的基因和基因?qū)M(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單基因敲除結(jié)果

通過(guò)模擬單獨(dú)敲除每個(gè)基因?qū)δＰ偷挠绊?，并找出敲除后?huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)降為0的基因，稱(chēng)為致死基因，見(jiàn)表2和圖1所示。

表2 致死基因

圖1 致死基因結(jié)果韋恩圖

兩個(gè)模型共有的致死基因?yàn)?個(gè)，根據(jù)Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://reactome.org/)，它們都位于甘油磷脂代謝通路，參與了維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的心磷脂的合成和構(gòu)象轉(zhuǎn)化。其中有5個(gè)基因[PGS1(phosphatidylglycerophosphate synthase 1)、CRLS1(cardiolipin synthase 1)、CDS2(CDP-diacylglycerol synthase 2)、CDIPT(CDP-diacylglycerol——inositol 3-phosphatidyltransferase)和CMPK2(cytidine/uridine monophosphate kinase 2)]已在IMPC(International Mouse Phenotyping Consortium, https://www.mousephenotype.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中有小鼠的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，且都為敲除后致死基因，與我們的模擬一致。

HCC肝癌細(xì)胞模型特異的結(jié)果有12個(gè)，基于Reactome數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果表明其富集于線粒體的脂肪酸β氧化通路，對(duì)腫瘤細(xì)胞獲取增殖所需的大量能量有至關(guān)重要的作用，如圖2紅色框所示。不僅如此，HADHA(hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional multienzyme complex subunit alpha)、SPTLC1(serine palmitoyltransferase long chain base subunit 1)、ACADM(acyl-CoA dehydrogenase medium chain)、ECHS1(enoyl-CoA hydratase short chain 1)、CEPT1(choline/ethanolamine phosphotransferase 1)、PTDSS1(phosphatidylserine synthase 1)、ACADSB(acyl-CoA dehydrogenase short/branched chain)和PCYT1A(phosphate cytidylyltransferase 1, choline, alpha)都已被作為藥物靶點(diǎn)，在DrugBank(https://www.drugbank.ca/)數(shù)據(jù)庫(kù)中有記錄，未被收錄的基因如AGK(acylglycerol kinase)已在前列腺腫瘤中被證明能通過(guò)活化EGFR及下游的MAPK信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]，值得深入探索。

圖2 線粒體內(nèi)脂肪酸β氧化通路

正常肝細(xì)胞模型特異結(jié)果有8個(gè)，其中TECR(trans-2,3-enoyl-CoA reductase)和SGPL1(sphingosine-1-phosphate lyase 1)在IMPC數(shù)據(jù)庫(kù)中存在小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且為敲除致死基因。由于TECR參與了脂肪酸合成，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程有比較重要的作用，因此進(jìn)一步查看了模型TECR涉及的具體反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在正常肝細(xì)胞模型中共有28個(gè)僅能被TECR催化的反應(yīng)，其中有26個(gè)同樣存在于HCC肝癌細(xì)胞模型中，但這26個(gè)反應(yīng)的酶編碼基因并不是TECR，而是多個(gè)其他基因，說(shuō)明在HCC肝癌細(xì)胞中的確存在代謝重編程以保證脂肪酸代謝通路的穩(wěn)定，從而在各種條件下都能為腫瘤細(xì)胞增殖提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。除此之外，GUK1(guanylate kinase 1)是將治療癌癥的前體藥物轉(zhuǎn)化為有藥理活性代謝物的關(guān)鍵基因[14]，因此敲除它也只會(huì)使正常肝細(xì)胞死亡，而不會(huì)對(duì)HCC肝癌細(xì)胞有影響。

2.2 雙基因敲除結(jié)果

利用雙基因敲除，嘗試找出單獨(dú)失活對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響、但組合敲除卻會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)降為0的基因?qū)ΓQ(chēng)為組合致死基因?qū)?，如?所示。

表3 組合致死基因?qū)?/p>

兩個(gè)模型共有的結(jié)果為15對(duì)，其中有12個(gè)基因?qū)Χ加?個(gè)相同的基因NPC1L1(NPC1 like intracellular cholesterol transporter 1)，它編碼的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)將外部膽固醇運(yùn)入胞質(zhì)以滿足生化需求，而與其組合致死的基因則都屬于膽固醇合成通路?？疾靸蓚€(gè)模型的特異結(jié)果，發(fā)現(xiàn)也各自有3個(gè)基因?qū)蠳PC1L1，且與其組合致死的基因同樣屬于膽固醇合成通路。因此推斷組合致死的原因是細(xì)胞無(wú)法從外部攝取膽固醇，同時(shí)內(nèi)部合成途徑被阻礙，造成膽固醇不足，無(wú)法維持正常生化過(guò)程。

除此之外，HCC肝癌細(xì)胞模型還有7對(duì)特異組合致死基因；正常肝細(xì)胞模型有9對(duì)，其中4對(duì)結(jié)果比較特別：PTDSS1和PCYT1A，在HCC模型中單敲就會(huì)致死，而在正常肝細(xì)胞模型中，它們與PTDSS2(phosphatidylserine synthase 2)或PCYT2(phosphate cytidylyltransferase 2, ethanolamine)組合敲除才會(huì)對(duì)細(xì)胞有致命影響。探究其生化功能發(fā)現(xiàn)：作為磷脂酰物質(zhì)循環(huán)的重要基因，PTDSS1與PCYT1A位于膽堿(choline, Cho)通路上，而PTDSS2和PCYT2負(fù)責(zé)催化乙醇胺(ethanolamine, ETA)通路上的反應(yīng)，如圖3所示。不僅如此，膽堿通路負(fù)責(zé)催化甘油二酯生成磷脂酰膽堿的CEPT1基因也出現(xiàn)在HCC細(xì)胞特異性單敲致死的結(jié)果中(表2)，而乙醇胺通路上的EPT1和PEMT基因在HCC模型中先天性缺失。因此推測(cè)：在正常肝細(xì)胞中，磷脂酰物質(zhì)循環(huán)可以靈活地由膽堿或者乙醇胺兩條途徑完成；而在HCC細(xì)胞中發(fā)生了代謝重編程，使乙醇胺途徑變得可有可無(wú)，在這種情況下，膽堿通路對(duì)于HCC肝癌細(xì)胞的重要性急劇增加，導(dǎo)致單獨(dú)敲除其通路的任一關(guān)鍵基因就會(huì)使腫瘤細(xì)胞死亡，與先前Glunde等[15]和Ikawa等[16]在小鼠中得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

紅色為乙醇胺代謝通路；藍(lán)色為膽堿代謝通路

2.2.1 膽固醇合成通路揭示HCC肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因

如表3所示，對(duì)于膽固醇合成通路的特異性組合致死基因?qū)Γ琁DI1(isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1)、DHCR24(24-dehydrocholesterol reductase)和CYP51A1(cytochrome P450 family 51 subfamily A member 1)僅會(huì)使正常肝細(xì)胞生長(zhǎng)率降為0；MSMO1(methylsterol monooxygenase 1)、HMGCS1(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1)和FDPS(farnesyl diphosphate synthase)僅會(huì)使HCC肝細(xì)胞生長(zhǎng)率降為0。

比對(duì)兩個(gè)模型的基因，發(fā)現(xiàn)在HCC肝癌細(xì)胞中同時(shí)存在IDI1以及IDI2基因，且這兩個(gè)基因可以催化相同的反應(yīng)，因此敲除其中一個(gè)并不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致命影響。與此相反的是，HCC肝癌細(xì)胞缺少了HMGCS2基因，其對(duì)HMGCS1的依賴(lài)性大大增強(qiáng)。Wang等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明HMGCS2低表達(dá)能抑制半胱氨酸蛋白酶介導(dǎo)的凋亡途徑，同時(shí)增強(qiáng)c-Myc/cyclinD1和EMT信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移能力，因此HCC細(xì)胞很可能采取這種代謝重編程來(lái)加速腫瘤發(fā)生過(guò)程。

對(duì)于DHCR24，在正常肝細(xì)胞模型中查看了它單獨(dú)催化的反應(yīng)，共有5個(gè)，流值均不為0；然而其中僅有1個(gè)反應(yīng)在HCC肝癌細(xì)胞模型中的流值不為0，且負(fù)責(zé)催化的基因?yàn)镈HCR24、HADHA、EHHADH或ECHS1(HADHA和ECHS1是HCC細(xì)胞的單敲致死基因)，這說(shuō)明DHCR24對(duì)于HCC細(xì)胞來(lái)說(shuō)并不是優(yōu)勢(shì)基因，同時(shí)從側(cè)面證明了HADHA與ECHS1對(duì)HCC細(xì)胞的重要性。Wu等[18]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DHCR24會(huì)與腫瘤抑制子p53結(jié)合并取代其N(xiāo)端的裂解酶Mdm2，造成p53在細(xì)胞內(nèi)的累積，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，因此DHCR24的缺失反而可以提高腫瘤細(xì)胞生存率，與我們的模擬結(jié)果一致。

2.2.2 L-氯化棕櫚酰肉堿缺失誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡

組合敲除CPT1A(carnitine palmitoyl transferase 1A)和CPT1B(carnitine palmitoyl transferase 1B)基因會(huì)使HCC細(xì)胞生長(zhǎng)率變?yōu)?，但只會(huì)使正常肝細(xì)胞生長(zhǎng)率下降10.19%，說(shuō)明其是HCC細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。

CPT1A和CPT1B都屬于CPT1基因家族，在HCC模型中催化了64個(gè)位于肉堿代謝通路上的反應(yīng)。這條通路負(fù)責(zé)運(yùn)輸長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體基質(zhì)，以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)80%[19]的β氧化，釋放生化需求的絕大部分能量。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)CPT1A的缺失會(huì)導(dǎo)致脂肪酸代謝通路異變，從而提高細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的不耐受性[20]。

更進(jìn)一步解讀，發(fā)現(xiàn)CPT1A和CPT1B作用于運(yùn)輸棕櫚酰輔酶A(Palmitoyl-CoA, PALM-CoA)進(jìn)入線粒體內(nèi)膜，并與肉堿(Carnitine, CAR)生成L-氯化棕櫚酰肉堿(L-palmitoyl carnitine, LPCARN)的反應(yīng)。如果將它們組合敲除，會(huì)導(dǎo)致線粒體內(nèi)LPCARN含量的驟減。先前有試驗(yàn)證明LPCARN等?；鈮A的過(guò)量累積會(huì)引發(fā)各種代謝疾病[21]，并能通過(guò)調(diào)控IL6R表達(dá)來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)通路，加速腫瘤發(fā)生[22]，甚至高濃度LPCARN會(huì)導(dǎo)致各種癌癥，包括HCC肝癌[23]。因此，組合敲除CPT1A和CPT1B對(duì)HCC肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響遠(yuǎn)比對(duì)正常肝細(xì)胞的大，這也與模擬結(jié)果一致。

3 討論與總結(jié)

本文選取了基于相同初始模型構(gòu)建的HCC肝癌細(xì)胞模型和正常肝細(xì)胞模型進(jìn)行代謝分析，運(yùn)用單基因和雙基因敲除，探索在HCC肝癌發(fā)生過(guò)程中潛在的代謝重編程位點(diǎn)和生化機(jī)制，并結(jié)合IMPC以及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。

在單基因敲除致死的結(jié)果中，兩個(gè)模型共有的8個(gè)致死基因已有5個(gè)被IMPC數(shù)據(jù)庫(kù)中的小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)。HCC模型的特異性結(jié)果大多已被DrugBank收錄，剩余基因如AGK也在前列腺癌中被證明與細(xì)胞增殖相關(guān)，有望成為新的藥物靶點(diǎn)；與此同時(shí)，TECR和GUK1僅在正常肝細(xì)胞模型中有重要影響，暗示它們可能是潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)。

在雙基因敲除的結(jié)果中，缺失負(fù)責(zé)攝入外部膽固醇的NPC1L1基因后，膽固醇合成通路變成了細(xì)胞獲取膽固醇的唯一途徑，所以敲除其上的關(guān)鍵基因會(huì)使腫瘤/正常細(xì)胞都凋亡。不同的是，HMGCS2在HCC肝癌細(xì)胞中的缺失使其對(duì)HMGCS1的依賴(lài)性大大提高；而IDI2在HCC肝癌細(xì)胞中的存在使其對(duì)IDI1的依賴(lài)性大大降低。不僅如此，敲除膽固醇合成通路最后一步的必需基因DHCR24僅會(huì)導(dǎo)致正常肝細(xì)胞死亡，暗示在腫瘤細(xì)胞的膽固醇合成過(guò)程中，反應(yīng)極有可能在生成鏈甾醇后就終止了。先前有試驗(yàn)證明鏈甾醇可以取代膽固醇維持部分調(diào)控、代謝等生化功能[24]，但由于化學(xué)性質(zhì)差異，例如在肝臟中，某些?；D(zhuǎn)移酶與鏈甾醇的酯化度只有膽固醇的40%，所以若用鏈甾醇取代膽固醇會(huì)導(dǎo)致各類(lèi)疾病，也包括癌癥[25]。因此IDI2可能是潛在的HCC肝癌基因，而HMGCS2和DHCR24極有可能是HCC腫瘤發(fā)生過(guò)程的潛在抗腫瘤靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

另外，肝癌細(xì)胞乙醇胺通路關(guān)鍵基因的先天缺失，以及其對(duì)膽堿代謝通路關(guān)鍵基因缺失的不耐受暗示了在HCC腫瘤細(xì)胞中，膽堿代謝通路占據(jù)了磷脂酰物質(zhì)循環(huán)的主導(dǎo)作用，是值得深入研究的代謝重編程位點(diǎn)。

本文運(yùn)用代謝分析模擬得到的結(jié)果具有高解釋性且與先前的試驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明了研究方法可靠。癌癥代謝重編程是腫瘤細(xì)胞為了滿足增殖、避免凋亡而采取的普遍手段，通過(guò)模擬結(jié)合試驗(yàn)的方法，可以更高效地篩選潛在靶點(diǎn)，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。