徐 放，朱報(bào)著，潘 文，朱政財(cái)，鐘乃盛，李文業(yè)，趙強(qiáng)民

（1.廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520；2.廣州市增城區(qū)林業(yè)和園林科學(xué)研究所，廣東 廣州 511300；3.棕櫚生態(tài)城鎮(zhèn)發(fā)展股份有限公司，廣東 廣州 510627）

【研究意義】木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（MicheliaL.）有80余種植物，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)。該屬樹(shù)種樹(shù)型優(yōu)美、香氣怡人，被廣泛應(yīng)用于園林綠化中，且兼具材用、藥用和油脂用等用途，具有廣闊的應(yīng)用前景［1-5］。含笑屬種間生殖隔離較弱，表型變異豐富，部分植物的分類和親緣關(guān)系在學(xué)術(shù)界仍有爭(zhēng)議［6］，急需在含笑屬中開(kāi)展親緣關(guān)系研究，明晰各種間遺傳關(guān)系，為后續(xù)開(kāi)展種間雜交和優(yōu)良新品種選育提供有力的指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記已經(jīng)在含笑屬植物遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究中得到應(yīng)用。王艇等［7］首次利用RAPD標(biāo)記開(kāi)展了含笑屬中4個(gè)含笑亞屬的系統(tǒng)發(fā)育研究。王亞玲等［8］利用trnL內(nèi)含子及trnL-trnF間隔區(qū)序列對(duì)多個(gè)含笑屬植物進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列的插入可以作為系統(tǒng)發(fā)育分析的依據(jù)之一。滕花景［9］篩選了19個(gè)RAPD標(biāo)記對(duì)樂(lè)昌含笑（Michelia chapensis）6個(gè)群體進(jìn)行聚類分析。柴弋霞［10］開(kāi)發(fā)ISSR標(biāo)記對(duì)紫花含笑（M.crassipes）及其與近緣種的雜交子代進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)子代分子標(biāo)記分型結(jié)果與形態(tài)學(xué)標(biāo)記一致。李劍等［11］將AFLP和ISSR標(biāo)記共同用于含笑屬植物的親緣關(guān)系分析，初步得出7種進(jìn)化歷程。王猛等［12］利用10個(gè)ISSR分子標(biāo)記對(duì)云南省內(nèi)的48種野生木蘭科植物進(jìn)行親緣關(guān)系初步分析，并劃分為7個(gè)類群，其中含笑屬17個(gè)種被劃分到6個(gè)不同類群中，該研究發(fā)現(xiàn)基于分子標(biāo)記的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)存在一定的差異。溫強(qiáng)等［13］利用ISSR標(biāo)記對(duì)3個(gè)墨紫含笑新品種和4個(gè)近緣種進(jìn)行了親緣關(guān)系的評(píng)價(jià)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前本研究供試的廣東含笑等11個(gè)含笑屬物種表型多樣，親緣關(guān)系尚不清楚，急需通過(guò)穩(wěn)定的分子標(biāo)記對(duì)不同物種進(jìn)行基因分型和親緣關(guān)系分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究在收集含笑屬資源的基礎(chǔ)上，利用基于M13熒光標(biāo)記的12對(duì)SSR引物獲取11個(gè)含笑屬物種的基因型，并對(duì)不同物種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，計(jì)算不同物種間的遺傳距離，旨在建立一個(gè)高效的含笑屬植物的基因分型體系，為含笑屬的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與DNA提取

供試的11個(gè)含笑屬物種采自廣東省林業(yè)科學(xué)研究院種質(zhì)資源圃（表1），分別編號(hào)M01～M11，采集生長(zhǎng)良好的葉片，液氮速凍后放入-80℃超低溫冰箱保存。選用0.2～0.3 g葉片利用震蕩研磨儀破碎，采用改良CTAB法［14］進(jìn)行DNA提取，利用Nanodrop2000（Thermo，美國(guó)）核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，稀釋至50 ng/μL備用。

1.2 引物篩選

參照Sun等［15］和李紅英等［16］論文中的引物信息合成40對(duì)引物，稀釋至10 μmol/L備用，選擇11個(gè)物種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含DNA模板2 μL、正反引物各0.4 μL、PCR Mix（上海生工，上海）10 μL和ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。選取擴(kuò)增成功率90%以上的引物共計(jì)12對(duì)，用于后續(xù)試驗(yàn)以獲取各物種的基因型。

1.3 基因分型體系建立

選用基于M13序列的熒光標(biāo)記方法獲取基因型［17］，在M13序 列TGTAAAACGACGGCCAGT的3′端分別添加6-FAM、HEX、TAMRA和ROX作為熒光標(biāo)記引物，12個(gè)標(biāo)記的正引物進(jìn)行重新合成，在正引物3′端添加M13序列，其序列見(jiàn)表2?；蚍中蚉CR反應(yīng)體系為20 μL，包含DNA模板2 μL、M13標(biāo)記0.4 μL、正引物0.15 μL、反引物0.4 μL、PCR Mix 10 μL和ddH2O 7.05 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s、56℃退火45 s、72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；94℃變性40 s、53℃退火45 s、72℃延伸45 s，8個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物利用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，使用LIZ-500作為內(nèi)標(biāo)。

表2 基因分型使用的引物信息Table 2 Primer information in the genotyping experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GeneMarker v 2.05軟件［18］對(duì)基因分型的結(jié)果進(jìn)行判讀，獲取原始片段長(zhǎng)度數(shù)據(jù)后，利用Excel的宏文件Flexibin進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。利用GenAlex6.5［19］計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性指數(shù)（I）和表觀雜合度（Ho）。利用Cervus［20］計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）。獲取各物種的基因型數(shù)據(jù)后，利用DARwin軟件［21］進(jìn)行不同物種間的親緣關(guān)系分析，構(gòu)建基于非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）的Neighbor-Joining（NJ）聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的種間通用性

利用40對(duì)引物對(duì)11個(gè)物種進(jìn)行擴(kuò)增的結(jié)果顯示，不同引物擴(kuò)增成功率在40%～100%之間，總體擴(kuò)增成功率為66.5%。2%瓊脂糖電泳顯示無(wú)非特異產(chǎn)物的引物共計(jì)12對(duì)，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度均在350 bp以下（圖1），其中5對(duì)引物可以在全部11個(gè)物種中高效擴(kuò)增（表3），12對(duì)引物擴(kuò)增成功率從72.7%～100%不等、平均為90.9%，以上12對(duì)引物用于本研究的后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 遺傳多樣性分析

獲取11個(gè)物種的基因型后開(kāi)展遺傳多樣性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。位點(diǎn)LT106擴(kuò)增獲得的等位基因數(shù)最多、為12個(gè)，位點(diǎn)LT47擴(kuò)增獲得的等位基因數(shù)最少、僅4個(gè)。12個(gè)標(biāo)記的有效等位基因數(shù)的變化范圍為2.909～10.083；Shannon多樣性指數(shù)（I）為1.303～2.437；觀測(cè)雜合度（Ho）最小為0、最大為0.818；期望雜合度（He）變化區(qū)間為0.656～0.901，多態(tài)信息含量（PIC）為0.671～0.880。

2.3 11個(gè)含笑屬物種的親緣關(guān)系分析

DARwin軟件獲得的NJ聚類圖如圖2所示，由圖2可知，11個(gè)物種被劃分成3個(gè)不同的重要分支，其中第一分支的物種為廣東含笑（M.guangdongensis）、金葉含笑（M.foveolata）、醉香含笑（M.macclurei）、石碌含笑（M.shiluensis）和苦梓含笑（M.balansae）；第二分支包括2個(gè)物種，分別為深山含笑（M.Maudiae）和含笑（M.f igo）；第三個(gè)分支的4個(gè)物種為白蘭（M.alba）、黃蘭（M.champaca）、紫花含笑（M.crassipes）和樂(lè)昌含笑（M.chapensis）。第一分支和第二分支上的7個(gè)物種均屬于后生含笑亞屬，而第三個(gè)分支上的4個(gè)物種中，樂(lè)昌含笑屬于后生含笑亞屬，另外3個(gè)物種屬于含笑亞屬。

3 討論

SSR標(biāo)記廣泛分布于真核生物的基因組中，作為共顯性標(biāo)記，相比于傳統(tǒng)的RADP、ISSR和AFLP等顯性標(biāo)記類型，可以更準(zhǔn)確地獲得生物遺傳信息。由于SSR標(biāo)記具有高度變異、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，因此可以作為物種分類、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、雜交親本選擇等遺傳分析的重要工具。李清瑩［22］在醉香含笑中開(kāi)發(fā)了SSR標(biāo)記，并對(duì)醉香含笑的種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)合生長(zhǎng)表型評(píng)選出優(yōu)良種源和家系。鄭紀(jì)偉等［6］利用13個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)8種含笑進(jìn)行了種質(zhì)指紋圖譜的構(gòu)建。另外，在木蘭科鵝掌楸（Liriodendron chinense）［23-25］中分別進(jìn)行了SSR引物開(kāi)發(fā)和雜交種判別和自然條件下物種漸滲等研究，為鵝掌楸的新品種選育提供了重要指導(dǎo)。以上研究均表明SSR標(biāo)記可在遺傳分析中獲得良好效果。本研究中選用的SSR標(biāo)記多態(tài)性好，平均PIC值達(dá)到0.769，擴(kuò)增成功率較高、達(dá)90.9%，且100%位點(diǎn)具有多態(tài)性，相比于近年來(lái)前人在十字花科（Brassicaceae）［26］、榛屬（Corylus）［27］和玉葉金花屬（Mussaenda）［28］中的親緣關(guān)系分析研究，本研究中引物擴(kuò)增成功率和多態(tài)性均有顯著提升，以上數(shù)據(jù)表明應(yīng)用該12組引物可以較為準(zhǔn)確地反映試驗(yàn)材料的遺傳信息，可以作為后續(xù)雜交親本篩選和雜交子代判定的重要工具。本研究中選用了經(jīng)濟(jì)性較好的基于M13序列的熒光標(biāo)記方法，相比于傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺（PAGE）檢測(cè)，可顯著提升實(shí)驗(yàn)效率，并實(shí)現(xiàn)了試驗(yàn)結(jié)果的數(shù)字化讀取，避免了人工讀取造成的較大誤差。另外，與在正引物的3′端直接進(jìn)行熒光標(biāo)記的試驗(yàn)方法相比，本試驗(yàn)中采用的方法可以使總體試驗(yàn)成本降低40%以上。

表3 各標(biāo)記在11個(gè)含笑屬物種中的擴(kuò)增成功情況Table 3 Successful amplification of SSR markers in 11 Michelia species

表4 11個(gè)含笑屬物種的遺傳多樣性信息Table 4 Genetic diversity information of 11 Michelia species

木蘭科中屬種的劃分，因不同物種的性狀相似性較高，一直是分類學(xué)家爭(zhēng)論的熱點(diǎn)，而含笑屬的系統(tǒng)分類更是爭(zhēng)論的焦點(diǎn)［3］。含笑屬植物在屬下等級(jí)的劃分經(jīng)歷了較長(zhǎng)的發(fā)展歷史，但仍存在較大分歧，目前主要有劉玉壺［29］及Chen等［30］提出的兩套不同分類系統(tǒng)。本研究將11個(gè)含笑屬物種進(jìn)行了聚類，其中廣東含笑、金葉含笑和醉香含笑的親緣關(guān)系較近，Yan等［31］于2004年首次報(bào)道該物種時(shí)，根據(jù)其葉片、花瓣和花蕊形態(tài)和發(fā)現(xiàn)地的地理環(huán)境等，認(rèn)為廣東含笑與金葉含笑和醉香含笑的親緣關(guān)系最為接近，有可能為自然條件下二者的變種或雜交種，本研究支持了相關(guān)結(jié)論。另外，本研究可以將11個(gè)物種分屬兩個(gè)亞屬的差異體現(xiàn)出來(lái)，證明本研究開(kāi)發(fā)的基因分型體系準(zhǔn)確性較高。目前，含笑屬新品種的雜交選育研究逐步興起，如中南林業(yè)科技大學(xué)通過(guò)種間雜交獲得多個(gè)含笑的新品種，并獲得國(guó)家林業(yè)局的新品種授權(quán)［32］。王晶等［33］利用金葉含笑和廣東含笑進(jìn)行雜交，選育出矮化、多花且花色特異的新品種。隨著含笑屬物種和新品種的逐漸增加，為了更加準(zhǔn)確地進(jìn)行含笑屬物種的分類和親本溯源，可以使用本研究開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記，結(jié)合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多種方法進(jìn)行分析，從而進(jìn)行更加準(zhǔn)確的親緣關(guān)系劃分，為后續(xù)的含笑屬植物保護(hù)和利用提供有力指導(dǎo)。

4 結(jié)論

利用SSR標(biāo)記進(jìn)行含笑屬親緣關(guān)系的研究，有助于開(kāi)展后續(xù)的物種利用和保護(hù)工作。本研究利用12對(duì)高多態(tài)性引物構(gòu)建了11個(gè)含笑屬物種的基因分型體系，分析了不同物種間的親緣關(guān)系，構(gòu)建了Neighbor-Joining進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明廣東含笑、金葉含笑、醉香含笑、石碌含笑和苦梓含笑的親緣關(guān)系較近，深山含笑和含笑的遺傳距離較近，樂(lè)昌含笑與屬于含笑亞屬的白蘭、黃蘭和紫花含笑遺傳關(guān)系較為緊密。