步洪石，王仁廣，胡力銘，趙天倚，王 檀，王淑敏※

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117；2.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林長春130021）

2020年1月，中國科學家首次鑒定出導致重癥肺炎的新型冠狀病毒即2019-nCoV[1]。2019-nCoV屬于屬的新型冠狀病毒，主要傳播途徑為呼吸道飛沫和接觸傳播，人群普遍易感，根據目前的病理觀察，對肺臟、脾臟、心臟、肝臟和腎臟等多組織器官皆有損害的可能[2]，治療手段一般為支持治療及服用抗病毒藥物等，炎癥因子風暴在普通型患者轉重癥的過程中起到了推波助瀾的作用，加重了器官損傷程度。

“除濕防疫散”是吉林省抗擊“新冠肺炎”輕癥期的有效方劑，在臨床上發(fā)揮了重要的作用。該方是經典名方《平胃散》的變方，由蒼術（15 g）、陳皮（15 g）、厚樸（10 g）、炙甘草（5 g）、干姜（5 g）和大棗（5 g）組成，具有除濕運脾、溫中和胃、扶正辟疫的功效，用于肺脾氣虛患者改善身體狀態(tài)，提升人體防御（濕）疫毒侵襲的能力。本研究以網絡藥理學方法探討除濕防疫散預防新型冠狀病毒肺炎感染的作用靶點與機制，預測防治機理，為臨床施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 除濕防疫散中化合物及靶標蛋白篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com）[3]，分別以“蒼術”、“陳皮”、“甘草”、“生姜”、“大棗”和“厚樸”為關鍵詞搜索并篩選符合口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性指數（Drug-like，DL）≥0.18的化學成分作為活性成分，并得到相關靶標蛋白。

1.2 靶標基因名轉換及藥材-化合物-靶標網絡的構建

借助Uniprot（https://www.uniprot.org/）數據庫對靶標蛋白進行對應的基因名轉換，并使用Cytoscape3.7.2軟件構建藥材-化合物-靶標網絡。

1.3 蛋白互作（PPI）網絡構建

利用STRING 11.0（https://string-db.org/）平臺對靶標進行蛋白互作分析，Organism設定為人（Homo sapiens），將最低要求互作值（minimum required interaction score）設置為最高，隱藏無連接靶點，輸出TSV格式文件，導入Cytoscape進行Network Analyzer，分析規(guī)則為節(jié)點的大小、邊的粗細分別按照度值由小到大遞增，節(jié)點及邊的顏色分別按度值及綜合評分遞增，由冷色到暖色渲染。

1.4 靶點的基因本體及通路富集分析

為了進一步了解1.2篩選出的靶標蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將所得除濕防疫散的作用靶點導入metascape數據庫（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）[4]，該庫整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等多個數據庫，數據更新快，可完成通路富集和生物過程注釋，上傳靶基因名稱列表文本文檔，限定物種為人，gene ID轉換后，進行GO生物學過程注釋、聚類分析和KEGG通路富集分析，將所得KEGG分析結果前20個條目進行P值轉換，以符合標準上傳格式，運用Omicshare繪圖云平臺（https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble）對其結果進行氣泡圖繪制。

1.5 分子對接

結合現有分子對接研究篩選“2.1”節(jié)關鍵化合物，選擇尚未進行對接研究的化合物與血管緊張素轉化酶II（ACE2）和SARS-CoV-23CL水解酶進行分子對接；通過PubChem查詢相應化合物結構，保存為SDF格式，導入Chem3D軟件優(yōu)化空間結構，使能量最小化，保存為mol2格式，導入分子對接軟件AutoDock Tools1.5.6 進行加氫，計算電荷及加root操作后保存為pdbqt格式文件。從蛋白質數據庫PDB（https://www.rcsb.org/）下載SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2的三維晶體pdb格式（PDB ID為6LU7和1R4L），導入Pymol軟件對蛋白進行去水，去除小分子配體后，導入Auto-Dock Tools進行加氫，計算電荷后保存為pdbqt格式文件。通過AutoDock Vina 4.0進行分子對接，將最優(yōu)對接結果導入Pymol進行可視化處理。

2 結果

2.1 除濕防疫散中藥活性成分及靶標篩選結果

圖1除濕防疫散藥物-成分-靶點網絡Fig.1 Dehumidification and anti-epidemic powder drug-component-target network

TCMSP數據庫對除濕防疫散組方進行檢索共得到活性成分102個，其中蒼術4個，陳皮4個，大棗12個，甘草76個，生姜4個，厚樸2個，柚皮素（naringenin）為陳皮和甘草共有成分，槲皮素（quercetin）、丁子香萜（Mairin）為大棗和甘草共有成分，-谷甾醇（beta-sitosterol）及豆甾醇（Stigmasterol）為大棗和生姜共有成分；活性成分對應靶點1613個，剔除重復最終獲得97個活性成分、227個靶點。Cytoscape構建所得藥材-成分-靶點網絡見圖1，內圈綠色為藥物，藍色為成分，外圈黃色為靶點。拓撲網絡分析得到度值前5位的成分為MOL000098（槲皮素）、MOL000422（山柰酚）、MOL000173（漢黃芩素）、MOL004328（柚皮素）和MOL003896（7-甲氧基-2-甲基異黃酮），對應度值分別為137、86、76、70和60。

2.2 PPI網絡構建結果

通過STRING 11.0平臺對組方靶點分析，獲得PPI網絡圖。網絡統(tǒng)計節(jié)點數量共226個，邊數量897條，平均節(jié)點度7.94，PPI富集P＜10-16，平均局部聚類系數0.439。通過Cytoscape對PPI網絡進行Network Analyzer得到圖2，以度值排序得到交互作用較多的靶標前10個為SATA3、JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK 14、CXCL 8、FOS和EGFR。SATA 3、JUN、FOS、MAPK和EGFR系列為癌基因，涉及細胞發(fā)育分化等，有研究表明，SATA3表達與腫瘤的生物學特征均有一定關系，SATA3的激活可能會增強扭曲蛋白（Twist）、上皮鈣黏素（E-cad）在胃癌組織中的表達[5]；RELA可調控NF-B炎癥信號通路系統(tǒng)[6]，與IL-6、CXCL8等炎癥因子存在協(xié)同作用，密切聯系著病毒、細菌感染患者的臨床癥狀。

2.3 GO富集分析及KEGG富集分析

以P＜0.01，最小計數為3，富集因子＞1.5篩選得到GO富集條目共計245條，其中前20條皆為生物過程（GO，Biological Processes），涉及激素水平的調節(jié)、對酮的反應、血液循環(huán)、血管發(fā)育和細胞死亡的陽性調節(jié)等，見圖3；基因功能聚類結果展示了各生物過程間的關系聯接，通常使用scores作為在豐度項上進行層次聚類時的相似度度量[7]，越高表示臨近調控關系越復雜，所處區(qū)域網絡核心性越明顯，相同大小的scores表示基因間的相似性及功能相關性很高。將score＞0.3的子樹視為一個聚類，共獲得21個子集，包括細胞對有毒物質、激素刺激、無機物、脂多糖、細菌起源分子、受傷、抗生素、細胞外刺激和氧化應激的反應等，見圖4和圖5。圖4是由群集ID著色的網絡，其中相同群集ID的節(jié)點顏色接近，圖5是由P值著色，其中含有較多基因的項具有較顯著的P值，即具有較深的著色；以P＜0.05篩選得到KEGG生物過程共計245條，其中前20條涉及癌癥相關途徑。糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、甲狀腺激素信號通路、沙門氏菌感染、NF-B信號通路、鈣信號通路、p53信號通路、癌癥中的轉錄失調、卵巢類固醇生成、朊病毒病、AMPK信號通路和PPAR信號通路等，見圖6。

圖2 PPI網絡分析Fig.2 PPI network analysis

圖3 GO富集分析前20條條目Fig.3 The first 20 entries of GO enrichment analysis

圖6 KEGG通路富集分析前20條條目Fig.6 The first 20 entries of KEGG channel enrichment analysis

2.4 分子對接結果

因槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、柚皮素與SARSCoV-23CL水解酶和ACE2的分子對接已有相關研究[8]，故選擇7-甲氧基-2-甲基異黃酮（MOL003896）作為配體進行分子對接。當分子與受體穩(wěn)定結合時，結合能（binding energy）越低，發(fā)生作用的可能性越大，結果顯示，MOL003896與SARS-CoV-23CL水解酶最小結合能為﹣6.1 kJ/mol，MOL003896與ACE2最小結合能為﹣8.4 kJ/mol，皆具有穩(wěn)定的結合表現。核心化合物MOL003896與SARS-CoV-23CL水解酶及ACE2對接模式見圖7和圖8。

圖7 MOL003896與SARS-CoV-2 3CL的對接模式圖Fig.7 MOL003896 and ACE2 docking mode diagram

3 討論

此次COVID-19以“寒、濕、瘀、虛”為主要病機特點，寒濕犯脾則邪毒易侵，除濕防疫散是平胃散的變方。劉瑤等[9]研究表明，平胃散可改善濕困脾胃證大鼠疲勞狀態(tài)，提高血漿肝糖原含量；李建等[10]研究表明，針對脾虛痰濁阻滯證痛風患者，平胃散合桂枝芍藥知母湯能夠減少痛風發(fā)作次數，降低尿酸水平，并減輕IL-1、IL-8等炎癥因子的反應。有相關文獻驗證[11]，PPI網絡分析得到的AKT1、IL-6、MAPK3等主要靶點，干預了COVID-19臨床治療中期階段?；虮倔w分析及通路富集分析結果展現了除濕防疫散對多種疾病具有潛在治療作用，最顯著的是對癌癥及腫瘤相關通路（p53信號通路，Wnt信號通路）的作用，對于細菌感染及朊病毒感染亦有效果。此外，還涉及多個炎癥及代謝相關信號通路的干預，如NF-B通過刺激因子（病毒、腫瘤壞死因子、B細胞活化因子和淋巴毒素等）的活化誘導相關靶基因的表達而產生多種細胞因子參與炎癥反應[12]。Ma等[13]研究發(fā)現，抗病毒作用可通過TLR4/NF-B信號通路相關炎性細胞因子的下調表達來實現；PPI網絡得到的核心靶點AMPK能通過調節(jié)氧化應激、抗炎等途徑減輕肺部相關疾病癥狀，如哮喘、肺部感染和肺損傷等[14]；PPAR在炎性細胞、腫瘤細胞、呼吸道上皮、支氣管黏膜下層和呼吸道平滑肌均有表達，有抑制炎癥、誘導細胞分化、抑制增殖和誘導凋亡等作用[15]。有分子對接相關文獻報道[8]，拓撲網絡分析得到的核心化學成分槲皮素、山柰酚、漢黃芩素和柚皮素等，與SARS-CoV-23CL水解酶和ACE2的結合能力優(yōu)于臨床推薦用藥，經分子對接驗證的7-甲氧基-2-甲基異黃酮（MOL003896）與ACE2及SARSCoV-23CL水解酶具有較好的對接活性，進一步體現了除濕防疫散針對COVID-19具有臨床治療潛力。綜上所述，除濕防疫散發(fā)揮抗病毒作用，一方面通過健脾利濕，扶正辟疫，提升脾虛濕滯患者抵抗外邪的能力，另一方面可能通過上述AKT1、IL-6、MAPK等靶點及NF-B、AMPK等炎癥代謝通路，抑制COVID-19過程中炎癥因子風暴的產生，起到抗病毒的作用。

有研究對新型冠狀病毒的傳播潛力進行了預估[16，17]，國內疫情狀況于6月出現轉暖，我國通過采取一系列預防控制和醫(yī)療救治措施，境內疫情上升的勢頭得到了有效遏制。病毒起源尚未確定，其傳播能力不容小覷。中醫(yī)中藥作為傳統(tǒng)醫(yī)學，千百年來保障著中國人的身體健康，是抵御多次重大疫情的強力工具。針對COVID-19，國家衛(wèi)健委已修訂發(fā)布了多版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，各省、市也相繼出臺了以中醫(yī)藥治療為手段的解讀方案，體現了中醫(yī)藥在COVID-19治療過程中至關重要的作用。針對此次冠狀病毒的預防，中醫(yī)始終提倡“治未病”[18，19]，包括未病先防、欲病救萌、既病防變和瘥后防復4個層次，尤其是針對易感人群，治未病原則顯得尤其重要?！饵S帝內經》有載：“正氣存內，邪不可干”，此次COVID-19中不乏年邁體弱的危重患者，該群體自身體質虛弱，多患有老年病及并發(fā)癥，免疫功能低下，易受病毒疫邪侵擾。除濕防疫散可調節(jié)機體環(huán)境，提升抵抗病毒的正氣，最終實現防病治病的目的。