姚東升，徐琳，2，蘭天鷹，葉朝陽，2，王琛，2，吳鋒

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學中醫(yī)腎病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

近年來，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)病率呈上升趨勢，已成為影響人類健康的主要疾病[1]。持續(xù)微炎癥狀態(tài)為CKD 疾病進程中的重要組成部分，并與腎功能下降程度密切相關。近年研究表明，腸道屏障功能下降，通透性增高，導致腸道細菌及內(nèi)毒素移位入血是造成CKD 炎癥狀態(tài)的原因之一[2-3]。上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院腎病科長期應用腎衰Ⅱ號方治療CKD，臨床療效顯著[4]。本課題組前期基礎研究顯示，該方可通過改善大鼠腎臟血氧供應環(huán)境、減少腎臟細胞凋亡及自噬、降低炎癥因子、抗氧化應激等藥理作用而減輕腎損傷[5-7]。臨床觀察顯示，該方改善CKD 3～4 期患者腎功能、延緩腎衰竭進展的作用機制可能與其減少炎癥因子、調(diào)節(jié)微炎癥狀態(tài)有關[8]，同時還觀察到食少納呆、大便不實等癥狀的改善。提示腸道可能是該方防治CKD、減輕腎毒素的重要藥理靶位。本研究觀察腎衰Ⅱ號方對腎功能衰竭大鼠腸通透性及微炎癥的影響，旨在從腸道通透性角度探討腎衰Ⅱ號方改善5/6 腎切除大鼠微炎癥狀態(tài)的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性SD 大鼠50 只，SPF 級，體質(zhì)量130～150 g，動物許可證號SCKC（滬）2018-0016，上海必凱實驗動物有限公司提供。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物房。

1.2 藥物

腎衰Ⅱ號方（黨參、丹參、川芎、桃仁、紫蘇葉、淫羊藿、制大黃各15 g），飲片購自上海市藥材公司。上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院中藥制劑室制備，水提濃縮至含原藥材7.58 g/mL。雙歧三聯(lián)活菌1 g，上海信宜制藥公司，批號20180521，加蒸餾水制備成50 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）測定試劑盒（南京建成生物制品研究所），內(nèi)毒素檢測試劑盒（美國ACC公司，貨號21080309C/BU0209），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C-反應蛋白（CRP）、白細胞介素（IL）-2、IL-6 和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA 檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），兔抗大鼠Anti-Occludin antibody（英國 Abcam 公司，貨號ab216327），Anti-Claudin-1 antibody（英國Abcam 公司，貨號ab15098），HRP 標記山羊抗兔IgG（中國Beyotime 公司，批號A0208），HRP 標記IgG（H+L）（中國Beyotime 公司，批號A0216）。M5 酶標儀（賽默飛），Leica DMIL 倒置相差顯微鏡（德國徠卡）。

2 實驗方法

2.1 造模

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，備皮后，脊柱向左旁開1 cm，左側(cè)肋弓下0.5 cm 處做一垂直于脊柱的切口（長約2.5 cm）。無菌條件下經(jīng)腹膜后鈍性游離腎包膜，暴露左腎，分支結(jié)扎左腎動脈2/3，關腹縫合。7 d 后摘除右腎。

2.2 分組與給藥

28 d 后，采用斷尾采血方式測定腎功能指標。剔除造模失敗和死亡大鼠，分別測量存活大鼠體質(zhì)量，并以其作為變量，隨機分為模型組、腎衰Ⅱ號方組和陽性對照組，每組10 只。另取10 只大鼠為假手術組。按成人標準體質(zhì)量（60 kg）常規(guī)用量20 倍給藥，藥物灌胃劑量參照本課題組既往研究[5]，給藥體積2 mL，每日1 次，連續(xù)60 d。假手術組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 標本留取

實驗大鼠禁食5 h 后灌服內(nèi)毒素，每10 min 灌服1 只，劑量10 mg/kg，3.5 h 后取材，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，打開腹腔，下腔靜脈取血，取大鼠部分腎臟、10%福爾馬林固定小腸，余腎臟及部分腸道組織-70 ℃低溫保存。

2.4 肌酐、尿素氮檢測

全血常規(guī)離心后取上清液，測試盒分析儀檢測Cr、BUN 含量。

2.5 內(nèi)毒素檢測

鰲試劑法檢測下腔靜脈血漿內(nèi)毒素含量，判定腸通透性變化，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.6 炎癥因子檢測

ELISA 檢測血清CRP、TNF-α、IL-2、IL-6、MCP-1含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

2.7 病理觀察

常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、HE 染色，鏡下觀察腎小球、腎小管、腎間質(zhì)、腎血管、腸道絨毛、隱窩腺體。

2.8 Claudin-1、Occludin 蛋白表達檢測

免疫組化檢測腸道緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 的表達。常規(guī)切片，脫蠟乙醇水化，熱修復后加入一抗4 ℃濕盒孵育過夜。37 ℃復溫1 h，加入二抗，顯色，脫水，透明，封片。用PBS 作陰性對照。鏡下拍照，用Image-Pro Plus6.0 軟件對照分析，陽性表達以測得的平均光密度（IOD）表示。

2.9 Claudin-1、Occludin 基因表達檢測

RT-PCR 檢測腸道緊密連接蛋白 Claudin-1、Occludin 的mRNA 表達。引物序列見表1。提取總RNA 樣本，稀釋成相同濃度，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min，以特異性引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。程序：42 ℃、15 min，85 ℃、5 s，以cDNA 為模板擴增基因片段，見表1。反應條件：94 ℃、30 s，94 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，結(jié)果以Ct值表示，用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對表達量。

表1 各基因PCR 引物序列

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 一般情況

假手術組大鼠一般狀態(tài)良好，反應靈活，皮毛光滑，精力充沛；模型組大鼠精神萎靡，皮毛少榮，運動、覓食較少，體質(zhì)量增加遲緩；腎衰Ⅱ號方組、陽性對照組大鼠精神較前好轉(zhuǎn)，食欲尚可，無活動受限，體質(zhì)量增加明顯。給藥第6 周腎衰Ⅱ號方組1 只大鼠因灌胃不當意外死亡。

4.2 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠血清肌酐、尿素氮水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清Cr、BUN 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號方組血清Cr、BUN 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與陽性對照組比較，腎衰Ⅱ號方組血清BUN 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清Cr、BUN 含量比較（）

表2 各組大鼠血清Cr、BUN 含量比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05

4.3 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠血漿內(nèi)毒素水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血漿內(nèi)毒素含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號方組大鼠血漿內(nèi)毒素含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量比較（）

表3 各組大鼠血漿內(nèi)毒素含量比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

4.4 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠血清炎癥因子水平的影響

與假手術組比較，模型組血清炎癥因子含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號方組血清炎癥因子含量降低，除MCP-1 外差異均統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

4.5 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

假手術組大鼠腎臟病理基本正常；模型組腎單位結(jié)構雜亂，彌漫性硬化，腎小球可見球囊黏連，周圍可見纖維化；腎衰Ⅱ號方組和陽性對照組腎小球結(jié)構較模型組完整清晰，囊腔結(jié)構較模型組更完整，未見明顯粘連，腎小球纖維化有所減輕。見圖1。

4.6 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠腸組織病理形態(tài)的影響

模型組較假手術組小腸絨毛變短變寬、局部隱窩拉長；腎衰Ⅱ號方組、陽性對照組與假手術組接近。見圖2。

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（）

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)（HE 染色，×400）

圖2 各組大鼠腸組織形態(tài)（HE 染色，×100）

4.7 腎衰Ⅱ號方對模型大鼠腸組織 Claudin-1、Occudin 蛋白和基因表達的影響

免疫組化染色顯示，著色為棕黃至棕褐色，腸黏膜上皮細胞邊緣廣泛連續(xù)性著色，可見點狀或蜂窩狀聚集，模型組著色散亂不連續(xù)，明顯減少，各給藥組明顯好轉(zhuǎn)，見圖3、圖4。與假手術組比較，模型組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白和mRNA 表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，腎衰Ⅱ號方組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），mRNA 表達變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5、表6。

圖3 各組大鼠腸組織Claudin-1 蛋白陽性表達（免疫組化染色，×200）

圖4 各組大鼠腸組織Occludin 蛋白陽性表達（免疫組化染色，×200）

表5 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達比較（，IOD 值）

表5 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達比較（，IOD 值）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

表6 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin mRNA 表達比較（）

表6 各組大鼠腸組織Claudin-1、Occludin mRNA 表達比較（）

注：與假手術組比較，*P＜0.05

5 討論

臨床上微炎癥狀態(tài)常常無明顯癥狀，是在免疫復合物、微生物、內(nèi)毒素、補體等刺激下，機體產(chǎn)生以單核巨噬細胞系統(tǒng)激活，IL-2、IL-6、TNF-α 促炎因子釋放為主的全身性慢性炎癥狀態(tài)[9]。由腎小球系膜細胞（MC）分泌產(chǎn)生的IL-6、IL-2、TNF-α 等細胞因子，可與MC 上相應受體結(jié)合，刺激MC 增殖[8]。超量的IL-6、IL-2和TNF-α導致腎小球系膜細胞增殖、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉積，造成原發(fā)疾病進展。IL-2 通過激活及趨化嗜堿性粒細胞、中性粒細胞和T 細胞加劇急性炎癥反應。

炎癥是CKD 惡化的主要原因之一，但導致CKD炎癥反應的起源位點目前尚無定論。近年研究表明，腸道通透性增加，導致腸道細菌及內(nèi)毒素移位入血為造成CKD 炎癥狀態(tài)的原因之一[10-12]。腸道雖然為體內(nèi)消化器官，但卻是一個體內(nèi)延伸的外部環(huán)境，因為腸道內(nèi)包含人體最大的微生物群。腸道除消化食物、排泄廢物外，同時也可防止微生物及其有害產(chǎn)物進入內(nèi)環(huán)境。內(nèi)毒素是寄居在腸道的革蘭陰性細菌細胞壁分解出來的脂多糖，具有很高的免疫原性。當腸道屏障功能下降，腸道毒素尤其內(nèi)毒素入血，使黏附分子、趨化因子和細胞因子大量產(chǎn)生，造成全身系統(tǒng)性炎癥反應[13-14]。血清內(nèi)毒素含量可一定程度上反映腸道屏障功能變化。研究表明，益生菌的使用可改善CKD患者的免疫炎癥及氧化應激[15]。

腸道屏障功能的主要結(jié)構基礎為腸上皮細胞間的緊密連接、黏附連接等。其中緊密連接為最重要的連接方式，對維護上皮細胞極性及調(diào)節(jié)腸屏障的通透性發(fā)揮著最主要的作用[16]。緊密連接是由超過50 種蛋白質(zhì)組成的復合體，通過吻合點封閉細胞間隙。Occludin 及Claudins 是參與腸壁通透性的、調(diào)節(jié)緊密連接的主要結(jié)構蛋白之一[17-19]。緊密連接蛋白的減少或破壞將使腸道通透性增高，使大分子物質(zhì)（內(nèi)毒素、病原體等）從腸腔進入血液。

中醫(yī)藏象學說認為，五臟六腑相互關聯(lián)、互根互用。大便難解或大便溏泄等“腸”分清泌濁失律，傳導下注失司皆為“腎”病所累。《諸病源候論·大便病諸候》有“邪在腎，亦令大便難。所以爾者，腎臟受邪，虛則不能制小便，則小便利，津液枯燥，腸胃干澀，故大便難，又渴利之家，大便亦難，所以爾者，為津液枯竭，致令腸胃干燥”。腎衰Ⅱ號方寒熱并用，補瀉兼施，益氣活血，降濁解毒，標本兼顧。方中黨參補益脾氣，健脾止瀉；制大黃具有蕩滌腸道之功，通因通用，用于腑實泄瀉；黃連清熱燥濕，為治療濕熱下注及疫毒所致泄瀉要藥。在治療腎病同時，腎衰Ⅱ號方也為治療泄瀉常用藥物，提示腸道很可能是該方防治CKD、減輕腎毒素的重要藥理靶位。

實驗研究表明，5/6 腎切除大鼠模型存在腸道功能障礙、腸道通透性增加[3，20]。本實驗選用5/6 腎切除大鼠模型，參考腸通透性評價方式[21]，處死前予內(nèi)毒素灌胃，取材后測定血漿內(nèi)毒素含量以判斷腸道屏障功能。結(jié)果顯示，模型大鼠炎癥因子及內(nèi)毒素含量顯著升高，表明該模型存在腸道屏障受損、微炎癥狀態(tài)加劇。同時，緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin 表達下降，提示緊密連接破壞是該模型腸道機械屏障功能改變的主要原因。本實驗研究顯示，養(yǎng)血活血、降濁化瘀為功效的腎衰Ⅱ號方可改善模型大鼠腎功能，同時降低血清炎癥因子和內(nèi)毒素的含量，表明改善腸道屏障功能抑制腸源內(nèi)毒素入血降低微炎癥水平是該方有效治療腎功能衰竭的靶點之一。進一步檢測提示，該方可上調(diào)腸組織Claudin-1、Occludin 蛋白表達，提示緩解腸上皮細胞緊密連接破壞是該方修復腸道機械屏障功能的主要機制。

綜上，腎衰Ⅱ號方降低5/6 腎功能衰竭大鼠微炎癥的作用可能是通過改善腸道通透性而達到的。這為該方臨證運用與新復方開發(fā)佐以科學依據(jù)的同時，也為從“腎-腸”角度開展中醫(yī)藥防治慢性腎功能衰竭的研究提供可參考的路徑與方法。