種文強(qiáng)，張慧葉，王夢(mèng)靜，李昂，邢文文，王強(qiáng)，趙嫻，喬海法，楊曉航，劉奇

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046

阿爾茨海默?。ˋlzhermer disease，AD）多發(fā)生于老年人，是一種以進(jìn)行性記憶力喪失、認(rèn)知功能損害、行為異常和社交障礙為臨床特點(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病[1]。近年來(lái)隨著AD 研究的深入，其能量代謝機(jī)制引起了廣泛關(guān)注。線粒體作為細(xì)胞最主要的能量來(lái)源，大腦的高能量需求對(duì)能量供給和線粒體功能的變化非常敏感，使線粒體功能障礙及氧化應(yīng)激成為AD病理過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。Sirtuins 家族是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性的組蛋白去乙?；福?979 年首次由Rine 等[2]在酵母內(nèi)發(fā)現(xiàn)，被命名為“沉默信息調(diào)控因子2（SIR2），SIRT3 作為Sirtuins家族的一員[3-4]，主要定位于線粒體[5]，具有促進(jìn)機(jī)體能量生成和線粒體自噬發(fā)生、保護(hù)線粒體功能、提升線粒體生物合成能力、增強(qiáng)線粒體動(dòng)力學(xué)變化等作用[6]。但SIRT3 的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受到諸多因素調(diào)控，其中調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子GATA-2 具有調(diào)節(jié)AD 中差異表達(dá)基因的功能[7]；而在SIRT3 基因的內(nèi)含子上，存在著可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeat，VNTR），它具有增強(qiáng)子活性，并可增加SIRT3表達(dá)[3]。轉(zhuǎn)錄因子GATA-2 和c-Jun/c-Fos 過(guò)表達(dá)，可增強(qiáng)SIRT3 的VNTR 增強(qiáng)子活性[8]，從而增強(qiáng)SIRT3的表達(dá)及生物學(xué)功能。針刺從能量代謝角度治療AD療效已得到廣泛認(rèn)可，主要體現(xiàn)在改善線粒體超微結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、阻滯通透性轉(zhuǎn)換孔形成、改善線粒體動(dòng)力學(xué)等方面[9]，但其機(jī)制迄今尚未十分明了。百會(huì)為督脈和手足三陽(yáng)經(jīng)、足厥陰經(jīng)之交會(huì)穴，具有補(bǔ)益腦髓、通竅醒神功效；涌泉上承足太陽(yáng)膀胱經(jīng)之陽(yáng)，下合于足少陰腎經(jīng)之陰，可交通陰陽(yáng)氣血、開(kāi)竅醒神。二穴相合，遠(yuǎn)道取穴結(jié)合局部選穴，上下貫通，連接病位與臟腑，具有養(yǎng)腎精、通腦竅、祛邪毒、化濁氣、治療癡呆功效。基于AD 腎虛髓空的病機(jī)，本實(shí)驗(yàn)選取“百會(huì)”“涌泉”，觀察針刺對(duì)SAMP8小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 表達(dá)的影響，進(jìn)一步從保護(hù)線粒體、調(diào)節(jié)能量代謝的角度揭示針刺防治AD 的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

SAMP8 小鼠27 只，SAMR1 小鼠9 只，6 月齡，雄性，體質(zhì)量（30±5）g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物許可證號(hào) SCXK（京）2019-0008。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)針?biāo)幗Y(jié)合創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照12 h，自由攝食飲水，單籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，采用水迷宮實(shí)驗(yàn)剔除運(yùn)動(dòng)或感覺(jué)障礙對(duì)空間學(xué)習(xí)記憶有影響的小鼠，并將符合實(shí)驗(yàn)要求的SAMP8 小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、針刺組、抑制劑組各9 只，9 只SAMR1 小鼠作為空白組。

1.2 試劑

Anti-GATA-2 antibody，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)Ab 173817；Trizol，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號(hào)9108-1；3-TYP，MCE 中國(guó)公司，批號(hào)HY- 108331；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號(hào) 639549；Anti β-tubulin Mouse Monoclonal Antibody，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)CW0098；PVDF（0.45 μm），上海索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)HY- 108331；DAB 顯色試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AR1178；ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AR1197；PrimeScripTMRT reagent Kit，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，批號(hào) RR014A；Hoechst33342，Invitrogen 公司，批號(hào) H1399；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)AR0138。

1.3 儀器

ChemiDoc MP-Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)SYSTEM GelDoc XR+），勻漿機(jī)（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)XHF-D），高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司，型號(hào)CR22G），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)IMARK），濕轉(zhuǎn)槽（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)175-8001），高電流電泳儀PowerpacTMHc（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)1645050），手壓塑料封接機(jī)（南浦豐奇包裝廠，型號(hào)F-200），干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)WGLL-65BE），轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-2268），自動(dòng)脫水機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-TS3A），組織冷凍包埋機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-BM），恒溫水浴鍋（常州德歐儀器制造有限公司，型號(hào)HH-SI），PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)T100），Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司，型號(hào)JL-MWMG），0.25 mm×13 mm 華佗牌一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.4 干預(yù)

針刺組和抑制劑組針刺“百會(huì)”“涌泉”，“百會(huì)”向前平刺2 mm，“涌泉”向腳踝方向斜刺2 mm，雙側(cè)穴位隔日交換。進(jìn)針后，施以捻轉(zhuǎn)平補(bǔ)平瀉，5 min行針1 次，留針20 min。每日1 次，5 d 為1 個(gè)療程，每個(gè)療程結(jié)束后休息2 d，治療4 個(gè)療程。針刺療程結(jié)束后，水迷宮實(shí)驗(yàn)期間第1、3、5、7 日按50 mg/kg劑量給予抑制劑組腹腔注射SIRT3 抑制劑3-TYP，針刺組注射與抑制劑組等體積生理鹽水。空白組和模型組不做任何干預(yù)。上述措施均在小鼠清醒狀態(tài)下由固定實(shí)驗(yàn)人員用自制小鼠固定器進(jìn)行抓取和固定。

1.5 取材

末次水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組隨機(jī)選取小鼠5 只。2%戊巴比妥（0.2 mL/100 g）麻醉動(dòng)物后頸椎脫臼處死，冰上剝離海馬，左側(cè)用于Western blot 檢測(cè)，稱重后過(guò)液氮，置于凍存管；右側(cè)用于RT-PCR 檢測(cè)，置于無(wú)RNA 酶管過(guò)液氮并移至-80 ℃冰箱保存。余每組4 只小鼠，2%戊巴比妥麻醉并固定，剪開(kāi)腹部及胸骨左側(cè)肋骨，暴露心臟，經(jīng)左心室用50 mL 針管緩慢灌注20 mL 生理鹽水（預(yù)冷），同時(shí)助手剪開(kāi)右心耳，待右心耳流出液澄清無(wú)血液且肝和肺顏色變白再行灌注4%多聚甲醛（pH 7.4，4 ℃預(yù)冷）40 mL 固定腦組織直至小鼠后肢繃直，斷頭快速取腦，4%多聚甲醛（預(yù)冷）固定24 h，25%蔗糖溶液4 ℃過(guò)夜脫水，減少冰晶，OCT 包埋，冰凍切片機(jī)切片（10 μm），緩沖液中浸泡，-20 ℃冰箱保存，染色備用。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

參照Vorhees 等[10]推薦的水迷宮實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行，依次為4 d 可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)、3 d 定位航行實(shí)驗(yàn)和1 d 空間探索實(shí)驗(yàn)，共計(jì)8 d，治療后各實(shí)驗(yàn)再進(jìn)行1 次。將水池平分為4 個(gè)象限（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），放置三角形（綠色）、圓形（黃色）、正方形（藍(lán)色）、星形（紅色）標(biāo)記予以區(qū)分。水溫18～22 ℃，逃生平臺(tái)放入第Ⅱ象限，其中可視平臺(tái)高于水面2 cm，定位航行平臺(tái)低于水面2 cm。第1～4 日為可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，將小鼠從每個(gè)象限固定點(diǎn)輕放入水，逃避潛伏期設(shè)為60 s，記錄小鼠自開(kāi)始游泳至到達(dá)逃生平臺(tái)并成功停留3 s 所需時(shí)間，記作本次實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期。如果60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，當(dāng)次逃避潛伏期計(jì)60 s，由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)其爬上平臺(tái)，在平臺(tái)上停留并熟悉15 s 后開(kāi)始下一個(gè)象限。將4 次逃生平臺(tái)潛伏期均值作為該小鼠當(dāng)日逃避潛伏期。每只小鼠每日每個(gè)象限各測(cè)定1 次，完成4 次航行實(shí)驗(yàn)后，擦干小鼠毛發(fā)放回籠內(nèi)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剔除視覺(jué)、感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)能力障礙的動(dòng)物。第5～7日為定位航行實(shí)驗(yàn)，逃生平臺(tái)低于水面2 cm，操作同可視平臺(tái)，記錄動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的運(yùn)動(dòng)軌跡、逃避潛伏期及總路程。第8 日為空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去逃生平臺(tái)，其余操作同可視平臺(tái)，計(jì)算動(dòng)物游泳路程和穿越平臺(tái)次數(shù)，并記錄目標(biāo)象限時(shí)間，每個(gè)象限各進(jìn)行1 次，共4 次，平均值作為當(dāng)日成績(jī)。

1.6.2 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子GATA-2 mRNA 表達(dá)

Trizol 提取凍存海馬總RNA。用Prime-Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄得cDNA。按熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系。程序：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s（30 個(gè)循環(huán)）；72 ℃、10 min，短期貯存-4 ℃，長(zhǎng)期貯存-20 ℃。具體步驟參考TaKaRa 公司說(shuō)明書(shū)。RT-PCR 數(shù)據(jù)處理采用相對(duì)定量法，以GAPDH 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析相應(yīng)指標(biāo)的mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.6.3 免疫熒光檢測(cè)GATA-2 蛋白表達(dá)

切片室溫晾干，0.01 mol/L PBS 清洗3 次×5 min，均勻涂滴腦片上，封閉30 min；吸棄封閉液，0.01 mol/L PBS 浸洗3 次×10 min；用含3%BSA 及0.03%TritonX-100 的抗體稀釋液稀釋相應(yīng)的一抗至合適濃度，使腦片完全浸入液體，4 ℃過(guò)夜孵育；吸棄一抗稀釋液，0.01 mol/L PBS 清洗10 min×3 次；按比例配制熒光二抗，室溫避光孵育2 h；二抗孵育結(jié)束后，0.01 mol/L PBS 清洗10 min×3 次；加入Hoechst33342襯染細(xì)胞核，室溫避光孵育10 min，0.01 mol/L PBS清洗10 min×3 次，晾干，50%甘油-PBS 溶液封片（甘油∶PBS＝9∶1），4 ℃冰箱避光保存；熒光顯微鏡下拍照。

1.6.4 Western blot 檢測(cè)GATA-2 蛋白表達(dá)

-80 ℃冰箱取出冰凍海馬組織置于冰上，待其融化后移至1.5 mL 離心管，加入RIPA 蛋白裂解液，置于預(yù)先準(zhǔn)備的含碎冰的小燒杯內(nèi)勻漿，勻漿10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清，-20 ℃保存。采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)結(jié)果計(jì)算上樣量。5×loading buffer 按1∶5 比例加入配制好的蛋白樣品，95 ℃金屬浴10 min 使蛋白變性。制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜。PVDF 膜浸泡在40 mL 含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉2 h，將膜和稀釋好的一抗裝入封閉袋中，4 ℃搖床過(guò)夜。一抗孵育結(jié)束后用TBST 洗3 次×10 min。二抗室溫孵育2 h，結(jié)束后洗滌方法同封閉，配制發(fā)光液，并與膜進(jìn)行充分反應(yīng)，于Bio-Rad 發(fā)光儀下進(jìn)行曝光拍照，Image J 軟件定量分析電泳條帶的蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 針刺對(duì)SAMP8 小鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶能力和逃避潛伏期的影響

4 組小鼠可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)3 d 平均游泳總路程差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明4 組小鼠視覺(jué)、運(yùn)動(dòng)能力等對(duì)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響，見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組小鼠平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，其中水迷宮實(shí)驗(yàn)第4、5、7 日差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組小鼠第4、7 日平均逃避潛伏期明顯縮短，針刺組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與針刺組比較，抑制劑組小鼠第6 日平均逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3、表4。

表2 各組小鼠可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)游泳總路程比較（，mm）

表2 各組小鼠可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)游泳總路程比較（，mm）

表3 各組小鼠定位航向?qū)嶒?yàn)逃避潛伏期比較（，s）

表3 各組小鼠定位航向?qū)嶒?yàn)逃避潛伏期比較（，s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，☆P＜0.05；與針刺組比較，#P＜0.05

表4 空間探索實(shí)驗(yàn)各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較（）

表4 空間探索實(shí)驗(yàn)各組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，☆☆P＜0.01

2.2 針刺對(duì)SAMP8 小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 mRNA 表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 mRNA 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，針刺組小鼠海馬SIRT3調(diào)控因子GATA-2 mRNA 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 mRNA 表達(dá)比較（）

表5 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 mRNA 表達(dá)比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，☆P＜0.05

2.3 針刺對(duì)SAMP 小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 陽(yáng)性細(xì)胞平均表達(dá)面積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2陽(yáng)性細(xì)胞平均表達(dá)面積明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與針刺組比較，抑制劑組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 陽(yáng)性細(xì)胞平均表達(dá)面積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。Western blot 檢測(cè)結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與針刺組比較，抑制劑組小鼠海馬SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、圖3。

圖1 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（免疫熒光，×200）

圖2 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白免疫印跡圖

圖3 各組小鼠海馬線粒體SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白表達(dá)比較（，每組9 只）

3 討論

線粒體能量代謝機(jī)制作為AD 熱點(diǎn)研究方向之一，近年來(lái)取得了一系列重大進(jìn)展。線粒體三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP 作為高能量需求器官最重要的能量來(lái)源，對(duì)維持大腦神經(jīng)元尤其是海馬神經(jīng)元的功能完整性（蛋白質(zhì)降解、離子穩(wěn)態(tài)、囊泡運(yùn)輸和發(fā)射方式）起著重要作用。研究表明，AD 早期線粒體就已出現(xiàn)融合與裂解之間動(dòng)態(tài)平衡的破壞，并伴隨著線粒體數(shù)量減少、形態(tài)改變[11]，以及線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ活性降低所致的活性氧富集、Ca2+吸收過(guò)量、酶活性降低等病理改變，最終誘導(dǎo)β-淀粉樣蛋白（Aβ）的形成，而Aβ 進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激，最終造成惡性循環(huán)[12]。另外，AD 其他病理標(biāo)志物也與線粒體功能關(guān)系密切，如Tau 蛋白累積可使線粒體功能異常，影響AD 神經(jīng)元中細(xì)胞器的軸突運(yùn)輸并最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能紊亂。因此，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，改善其功能，對(duì)延緩AD 病理進(jìn)程、改善AD 患者的臨床癥狀有較大的作用，也是防治AD 的重要研究方向。

SIRT3 作為一種NAD+依賴的蛋白去乙?；?，主要定位于線粒體[5]，NAD+豐度的變化可直接影響SIRT3 活性，SIRT3 通過(guò)干預(yù)與線粒體穩(wěn)態(tài)有關(guān)的多種代謝調(diào)節(jié)劑脫乙?；瘏⑴c氧化應(yīng)激、能量代謝、線粒體功能調(diào)節(jié)[13]，同時(shí)參與電子傳遞鏈和ATP 合成[14]，一定程度上調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖、代謝、死亡和衰老，以及器官的長(zhǎng)壽[15]。實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，人腦的嗅皮質(zhì)、海馬區(qū)及白質(zhì)區(qū)SIRT3 表達(dá)隨著AD病情的進(jìn)展不斷減少[16]，SIRT3 的過(guò)表達(dá)可增加SIRT3 脫乙?；钚?，挽救線粒體功能和被Aβ 破壞的ATP 產(chǎn)生[17]。SIRT3 的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)受到許多因素的調(diào)控，GATA-2 就是其中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。

GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族是一類通過(guò)與DNA 序列（G/A）GATA（A/T）結(jié)合發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，是進(jìn)化保守的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在不同物種中廣泛表達(dá)，對(duì)增殖分化及基因調(diào)控起非常重要的作用[18]。主要包括GATA-1、GATA-2、GATA-3、GATA-4、GATA-5及GATA-6，其中GATA-2 是造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞的擴(kuò)展和維持所必需的轉(zhuǎn)錄因子，控制著干細(xì)胞的增殖及分化。在AD 研究中，轉(zhuǎn)錄因子GATA-2 研究相對(duì)較少，鑒于目前沒(méi)有可用的外周生物標(biāo)志物可以檢測(cè)AD 發(fā)作，有研究者通過(guò)對(duì)血液基因表達(dá)數(shù)據(jù)的綜合分析，采用微陣列數(shù)據(jù)鑒定出AD 患者和對(duì)照組的差異表達(dá)基因（DEG），確定25 個(gè)常見(jiàn)的DEG，明確GATA-2 作為AD 的常見(jiàn)轉(zhuǎn)錄因子之一[19]，具有調(diào)節(jié)AD 中差異表達(dá)基因的功能[7]。另外，對(duì)GATA-2的基因敲除研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球蛋白表達(dá)的減少[20]，且在SIRT3 基因的內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列具有增強(qiáng)子活性，并可增加SIRT3 表達(dá)[8]。轉(zhuǎn)錄因子GATA-2 和c-Jun/c-Fos過(guò)表達(dá)，可增強(qiáng)SIRT3 的VNTR增強(qiáng)子活性[9]，由于c-Jun/c-Fos 二聚體復(fù)合物可識(shí)別結(jié)合在SIRT3 基因串聯(lián)重復(fù)序列上的激活蛋白1，從而增強(qiáng)SIRT3 的表達(dá)及生物學(xué)功能。

AD 屬中醫(yī)學(xué)“呆證”范疇。結(jié)合前期研究，本研究從AD 腎虛髓空的病機(jī)出發(fā)，以益髓醒腦為主要治則，選用“百會(huì)”“涌泉”進(jìn)行治療。研究表明，針灸“百會(huì)”“涌泉”可改善線粒體酶活性[21]、提升海馬ATP 表達(dá)[22]、減輕線粒體損傷、改善AD 模型的學(xué)習(xí)記憶能力。臨床研究證實(shí)，針刺百會(huì)、涌泉可明顯提高AD 患者長(zhǎng)谷川癡呆修改量表、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表、日常生活能力量表、臨床神經(jīng)功能缺損量表及中醫(yī)辨證量表評(píng)分情況[23]，提高AD 治療效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，針刺可促進(jìn)SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白的表達(dá)，改善SAMP8 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提示作為轉(zhuǎn)錄因子GATA-2 的下游蛋白，SIRT3可在GATA-2 蛋白過(guò)表達(dá)的作用下，發(fā)揮維持線粒體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、增強(qiáng)線粒體酶活性、減少活性氧產(chǎn)生、改善能量代謝等生物學(xué)功能，從而延緩AD 的進(jìn)展。另外，本實(shí)驗(yàn)RT-PCR 結(jié)果與蛋白檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)不一致，但考慮到基因的表達(dá)分為轉(zhuǎn)錄和翻譯2 個(gè)層面，即mRNA 和蛋白水平，而真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔，轉(zhuǎn)錄后又有轉(zhuǎn)錄后加工，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的降解、翻譯、翻譯后加工及修飾等幾個(gè)層面，所以轉(zhuǎn)錄和翻譯水平并不完全一致。另外，海馬組織線粒體中GATA-2 mRNA與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性尚未見(jiàn)明確報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)中GATA-2 mRNA 的表達(dá)有待今后繼續(xù)研究。

綜上所述，針刺可明顯改善SAMP8 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與促進(jìn) SIRT3 調(diào)控因子GATA-2 蛋白表達(dá)的升高，從而改善線粒體的功能、調(diào)節(jié)能量代謝有關(guān)。