洪苗苗 ，趙恩聰，陳麗敏，郭婉清，鄭家勇，林嵐，王豐，董衛(wèi)國(guó)

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；4.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種發(fā)生于老年期的退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為記憶喪失、認(rèn)知能力下降和進(jìn)行性癡呆[1]。主要病理特征為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)形成、神經(jīng)元喪失及突觸丟失。越來(lái)越多的研究表明，早期AD 突觸功能障礙先于神經(jīng)元死亡[2-4]。而突觸改變是AD 認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵病理因素，保持突觸的穩(wěn)態(tài)平衡可能是AD 治療的新策略。本課題組前期研究表明，“益腎調(diào)督”電針?lè)芨纳芐AMP8 小鼠突觸超微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)SAMP8小鼠突觸功能[5-7]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選取“百會(huì)”“大椎”“腎俞”，對(duì)3、6、9 月齡SAMP8 小鼠進(jìn)行電針治療，觀察小鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)與突觸功能相關(guān)的突觸素（synaptophysin，SYN）和突觸后致密物-95（postsynaptic density-95，PSD-95）表達(dá)的影響，從突觸功能角度探討電針治療AD 的介入時(shí)機(jī)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物及分組

SAMP8 小鼠48 只及對(duì)抗快速老化小鼠亞系SAMR1 小鼠12 只，3 月齡，雄性，體質(zhì)量20～25 g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部）提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2011-0012。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 主要試劑、儀器及針具

兔單克隆抗體SYN（貨號(hào)ab32127）、兔多克隆抗體PSD-95（批號(hào)18258），Abcam；β-actin（貨號(hào)20536-1-AP），Proteintech；生物素標(biāo)記羊抗兔IgG、DAB試劑盒，福州邁新生物工程有限公司。Motic Med 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，Bio-Rad 圖像分析系統(tǒng)，G6805-Ⅰ電針治療儀（青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司），0.25 mm×15 mm華佗牌一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及干預(yù)

將48 只SAMP8 小鼠隨機(jī)分為模型組、3 月齡電針組、6 月齡電針組、9 月齡電針組，每組12 只，另取12 只SAMR1 小鼠作為對(duì)照組。電針組采用自制網(wǎng)兜固定小鼠，選取“百會(huì)”“大椎”“腎俞”。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]取穴、定位，“百會(huì)”位于小鼠頂骨正中，“大椎”位于背部第7 頸椎與第1 胸椎間，“腎俞”位于第2 腰椎下兩旁。操作：“百會(huì)”向前斜刺2 mm，“大椎”向下斜刺2～3 mm，“腎俞”稍向內(nèi)斜刺3～4 mm，其中“大椎”“腎俞”予電針刺激，“腎俞”雙側(cè)隔日交替。連續(xù)波，頻率2 Hz，電流強(qiáng)度以引起小鼠后肢肌肉微顫而不嘶叫為宜，每次20 min，每日1 次，8 d 為1 個(gè)療程，每個(gè)療程間隔2 d，共3個(gè)療程。全部小鼠由3 月齡飼養(yǎng)至9 月齡，模型組和對(duì)照組除不予電針治療外，其余抓取和固定方式相同，于10 月齡統(tǒng)一取材。

2.2 免疫組化檢測(cè)突觸素和突觸后致密物-95 蛋白表達(dá)

每組取6 只小鼠，麻醉后灌流固定。取全腦修塊，置于4%多聚甲醛固定24～48 h。石蠟包埋，切片，制片。分別加入SYN 抗體（1∶200）和PSD-95 抗體（1∶200），濕盒孵育過(guò)夜。加入生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG 的二抗，DAB 顯色，封片。用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。以海馬CA1 區(qū)正上方皮質(zhì)區(qū)作為皮質(zhì)腦區(qū)觀察部位，鏡下觀察每張玻片相應(yīng)腦區(qū)5 個(gè)陽(yáng)性染色區(qū)域，以棕黃色作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，在相同條件下，拍照采集圖片。用Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)SYN 及PSD-95 圖片進(jìn)行分析，計(jì)算SYN及PSD-95 的平均光密度（MOD）。

2.3 Western blot 檢測(cè)突觸素和突觸后致密物-95 蛋白表達(dá)

每組取6 只小鼠進(jìn)行麻醉，生理鹽水灌注后快速斷頭取腦，分別采集皮質(zhì)和海馬組織，-80 ℃冰箱保存，稱組織濕重，裂解后取上清液，BCA 法檢測(cè)上清液蛋白濃度。蛋白樣品用10%SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，300 mA 轉(zhuǎn)蛋白至PVDF 膜。封閉2 h 后，加入SYN抗體（1∶3000）、PSD-95 抗體（1∶3000）、抗小鼠β-actin（1∶10 000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌；加入二抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000），室溫孵育2 h，TBST 洗滌。配制顯色液并覆PVDF 膜，1 min 后進(jìn)行圖像掃描，Bio-Rad 圖像分析系統(tǒng)分析。以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 免疫組化染色結(jié)果

皮質(zhì)區(qū)SYN 主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，PSD-95 主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞膜。與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組小鼠皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與3月齡電針組比較，6 月齡電針組、9月齡電針組皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖1～圖5。

圖1 各組小鼠皮質(zhì)SYN 陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖2 各組小鼠皮質(zhì)PSD-95 陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 各組小鼠海馬SYN 陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖4 各組小鼠海馬PSD-95 陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖5 各組小鼠皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95蛋白表達(dá)比較（，每組12 只）

4.2 Western blot 檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，電針組小鼠皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與3 月齡電針組比較，6 月齡電針組、9 月齡電針組皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖6～圖9。

圖6 各組小鼠皮質(zhì)SYN、PSD-95 蛋白免疫印跡圖

圖7 各組小鼠皮質(zhì)SYN、PSD-95 蛋白表達(dá)比較（，每組12 只）

圖8 各組小鼠海馬SYN、PSD-95 蛋白免疫印跡圖

圖9 各組小鼠海馬SYN、PSD-955 蛋白表達(dá)比較（，每組12 只）

5 討論

AD 屬中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇，為腎精虧虛、髓海不足所致，治以補(bǔ)腎益髓、開竅醒腦為主。中醫(yī)認(rèn)為，腎精充足，化髓上輸于腦，是記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)，督脈是腎氣精微輸布于腦的關(guān)鍵通道。本研究參考“益腎調(diào)督”電針?lè)?，選取“百會(huì)”“大椎”“腎俞”治療AD。百會(huì)屬督脈，有益智健腦、開竅醒神之功。大椎為督脈要穴，又與手足六陽(yáng)經(jīng)交會(huì)，具有通督開竅、振陽(yáng)升清、調(diào)神醒腦功效。腎俞屬足太陽(yáng)膀胱經(jīng)，相表里于足少陰腎經(jīng)，可振奮陽(yáng)氣、補(bǔ)腎益髓。故三穴配伍，可醒腦開竅、益腎調(diào)督。研究表明，針刺“百會(huì)”“腎俞”能有效減少AD 大鼠血清β-淀粉樣蛋白（Aβ）水平，降低海馬淀粉樣前體蛋白表達(dá)[9]。益腎調(diào)督法可減弱腦神經(jīng)性炎癥反應(yīng)，改善線粒體損傷，保護(hù)線粒體功能[10]。上述文獻(xiàn)與本課題組前期研究均顯示，益腎調(diào)督法對(duì)AD 具有較好的療效[5-7]。

AD 是以學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行性減退為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，晚期可伴有運(yùn)動(dòng)障礙。AD 病理標(biāo)志為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元缺失和突觸異常等[11]。以往認(rèn)為，AD主要累及與學(xué)習(xí)記憶功能及信息處理密切相關(guān)的海馬、大腦皮質(zhì)等部位。研究表明，在AD 患者和AD 動(dòng)物模型皮質(zhì)及海馬均可發(fā)現(xiàn)Aβ 及磷酸化Tau 蛋白的沉積等病理改變[12-13]。本課題組前期研究表明，AD 早期電針介入能有效改善SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬CA1 區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)，減少海馬Aβ、Tau蛋白的異常表達(dá)，且療效優(yōu)于AD 晚期電針介入治療[5，7]，為電針治療AD 的時(shí)機(jī)提供了依據(jù)。但電針對(duì)不同月齡SAMP8 小鼠皮質(zhì)區(qū)突觸功能影響還不十分明了。SAMP8 小鼠是一種理想的AD 模型，已廣泛用于AD 研究。研究表明，SAMP8 小鼠3 月齡時(shí)腦內(nèi)無(wú)Aβ 沉積及Tau 蛋白磷酸化，4～5月齡腦內(nèi)開始出現(xiàn)Aβ 沉積、Tau 蛋白磷酸化，6 月齡腦內(nèi)可見(jiàn)明顯Aβ 沉積、Tau 蛋白磷酸化[14]，9 月齡腦內(nèi)可見(jiàn)非常明顯Aβ 沉積、Tau 蛋白磷酸化[15]。另有研究表明，SAMP8 小鼠3 月齡學(xué)習(xí)記憶能力與SYN水平均正常，6 月齡可見(jiàn)學(xué)習(xí)記憶能力和SYN 水平下降，9 月齡顯著降低[16]。故本研究設(shè)計(jì)3 月齡、6 月齡、9 月齡電針組，分別代表AD 早期、中期、晚期3 個(gè)階段，觀察皮質(zhì)及海馬與突觸功能密切相關(guān)的SYN 和PSD-95 蛋白的表達(dá)，從突觸功能角度，進(jìn)一步探討電針治療AD 的時(shí)機(jī)。

SYN 是一種特異性存在于突觸囊泡膜上的鈣結(jié)合糖蛋白，可反映突觸的分布和密度，參與了突觸囊泡的運(yùn)輸、分泌和再循環(huán)等活動(dòng)，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌。SYN 通過(guò)調(diào)節(jié)軸突和樹突的分化和生長(zhǎng)，影響突觸結(jié)構(gòu)，是研究突觸功能的重要指標(biāo)[17]。PSD-95 是突觸后膜致密區(qū)上一種支架蛋白，是參與神經(jīng)突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用形成的重要物質(zhì)。PSD-95 能激發(fā)突觸的活性，參與突觸的連接和維持，簇集谷氨酸受體和N-甲基-D-天冬氨酸受體，提高信息傳導(dǎo)效率，增強(qiáng)突觸重塑[18]。Sze 等[19]發(fā)現(xiàn)，海馬內(nèi)SYN 表達(dá)的減少與AD 患者認(rèn)知功能的損傷正相關(guān)。Sultana 等[20]研究顯示，抑制小鼠PSD-95 表達(dá)將出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力障礙、突觸數(shù)量丟失及完整性缺失。由此可見(jiàn)，SYN和PSD-95 的蛋白表達(dá)水平是反映突觸功能的重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同月齡電針組均能上調(diào)皮質(zhì)及海馬SYN、PSD-95 蛋白的表達(dá)，提示電針能增強(qiáng)突觸功能。且治療越早，皮質(zhì)和海馬SYN、PSD-95表達(dá)水平越高，提示電針對(duì)AD 的改善程度與治療時(shí)機(jī)相關(guān)，早期療效優(yōu)于中期和晚期。

綜上所述，AD 早期電針介入能明顯提高皮質(zhì)及海馬SYN、PSD-95 蛋白的表達(dá)，改善突觸功能，其療效優(yōu)于AD 中晚期治療。這一結(jié)果為電針治療AD時(shí)機(jī)的選擇提供了新思路，但不同腦區(qū)之間突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性及電針早期介入療效優(yōu)于中晚期的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。