李 珂， 黃凱倫， 解新迪， 郭偉娜，劉 暢， 張 寧， 李賀俠， 路振香*

(1.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.南京市棲霞區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 南京 210046；3.安徽省和縣動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽 和縣 238200)

沙門氏菌(

Salmonella

) 是人和多種動(dòng)物的致病菌，各個(gè)年齡段的動(dòng)物均可感染沙門氏菌，但以幼年動(dòng)物更易感， 感染者主要表現(xiàn)為急性腹瀉、腸炎及敗血癥等。全世界每年大約有 1600 萬人感染沙門氏菌病，其中，因?yàn)楦腥驹摬《劳稣呒s 60 萬。沙門氏菌能引起多種動(dòng)物的全身性的感染以及人類的食物中毒等，全世界每年因沙門氏菌引起的食物中毒人數(shù)經(jīng)常占各類細(xì)菌性食物中毒首位。目前，沙門氏菌耐藥性問題日益突出，給臨床治療該菌造成的感染帶來很大困擾。

本研究擬對2018年以來養(yǎng)殖戶送檢的7個(gè)批次在當(dāng)?shù)亟?jīng)過治療沒有效果，以肝臟、脾臟腫大、瘀血斑駁樣，腸道廣泛性出血，氣囊渾濁為主要病理變化病死鵝進(jìn)行病原分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、毒力基因、耐藥基因的檢測，為養(yǎng)殖戶用藥提供指導(dǎo)，并對其致病機(jī)理和耐藥機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2018年初至2019年底安徽滁州地區(qū)養(yǎng)殖戶送檢的7個(gè)批次在當(dāng)?shù)亟?jīng)過抗菌藥物治療沒有任何效果的病死雛鵝若干只。

1.1.2 藥敏紙片 慶大霉素、復(fù)方新諾明、頭孢他啶、阿米卡星、頭孢唑林、大觀霉素、頭孢曲松等抗菌藥物紙片購于杭州濱和微生物試劑有限公司，生產(chǎn)批號(hào)是20190315。

1.1.3 試劑 引物均由安徽通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成。DL2000及2×Taq PCR MasterMixTM均購自寶生物工程(大連)有限公司。引物均由安徽通用生物技術(shù)(安徽)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)、純化 用無菌接種環(huán)蘸取病死鵝的肝臟組織，分別在營養(yǎng)瓊脂平板和麥康凱瓊脂上劃線進(jìn)行病原菌的分離，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。將麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)出的單個(gè)典型菌落劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上純化，挑取純化后的分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。

1.2.2 分離菌生化試驗(yàn) 將純化后的分離菌分別進(jìn)行糖發(fā)酵、吲哚形成、甲基紅、VP和產(chǎn)HS試驗(yàn)。

1.2.3 分離菌DNA模板制備 對病原菌進(jìn)行2次分離純化，待鏡檢確保無雜菌后，用水煮法提取分離菌的DNA模板。

1.2.4 分離菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增 使用細(xì)菌16S rRNA通用引物， 27F：5'-GCTTTATCCTCTGGCCTT-3' 和1492R：5'-GGTTAACCTTGTTACGACTT-3'。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，細(xì)菌模板2 μL，超純水19 μL。

PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.2.5 分離菌體外抑菌試驗(yàn) 采用圓紙片法。分別用無菌涂布棒蘸取適量分離菌新鮮純培養(yǎng)物均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板表面，將圓紙藥片均勻地貼于其上，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察記錄結(jié)果。

1.2.6 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[6～10]報(bào)道的沙門氏菌毒力基因序列合成試驗(yàn)所需的沙門氏菌毒力基因引物，引物序列如表1所示,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件見表2。

表1 分離菌毒力基因引物序列

表2 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCRbuffer 2.5 μL、細(xì)菌模板1 μL、dNTP 1 μL、Taq酶0.25 μL、超純水18.25 μL、上、下游引物各1 μL。

1.2.7 分離菌耐藥基因PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)[11～12]報(bào)道的沙門氏菌耐藥基因序列合成本次試驗(yàn)所需耐藥基因引物，引物序列如表3所示，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件，見表4。

表3 分離菌耐藥基因引物序列

反應(yīng)體系25 μL：PCRbuffer 5.0 μL、超純水15.75 μL、dNTP 1.0 μL、Taq酶0.25 μL、細(xì)菌模板1.0 μL、上、下游引物各1.0 μL。

1.2.8 瓊脂糖凝膠電泳 在1%瓊脂糖凝膠的第一孔加6 μL D2000Maker作為對照，其他孔分別加5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL Loading Buffer 的混合物。電壓設(shè)定為110 V，電泳30 min。

表4 分離菌耐藥基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察結(jié)果

從7個(gè)批次送檢的病死鵝肝臟組織中分離到7株均為革蘭氏陰性、單個(gè)散在的中等大小桿菌，該分離菌在麥康凱營養(yǎng)瓊脂平板上均為淡橘紅色透明、邊緣整齊、光滑、圓形的小菌落，在營養(yǎng)瓊脂平板上菌落均為灰白色圓形、邊緣整齊、光滑濕潤、半透明的小菌落。

2.2 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

7株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖和甘露醇既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，不能利用乳糖和蔗糖；吲哚形成試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)陽性，VP試驗(yàn)陰性，均產(chǎn)HS。

2.3 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

7株分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 7株分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分離菌16S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖1可知：擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的目的基因。

注：M：DL2000 marker；1～7：7株分離菌。

2.5 分離菌16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

由圖2可得，7株分離菌均與GenBank中的腸道沙門氏菌同源性在99%以上，因此，分離菌均為腸道沙門氏菌。

注: 圖中GSC1～7為7株分離菌的序列。

2.6 分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

分離菌毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果詳見圖3～5。結(jié)果顯示，7株分離菌均沒有擴(kuò)增出毒力島基因

misL

和毒力島基因

ssaB

。

注：M：DL2000 marker；1～7：7株分離菌。下同。

圖4 分離菌菌毛基因invJ凝膠電泳圖

圖5 分離菌菌毛基因sipA凝膠電泳圖

2.7 分離菌耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

由圖6～9可得，分離菌均沒有擴(kuò)增出喹諾酮類耐藥基因

qnr

。

圖6 分離菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blatem-1凝膠電泳圖

圖7 分離菌β-內(nèi)酰胺類耐藥基因baCMY-2凝膠電泳圖

圖8 7株分離菌磺胺類耐藥基因sul1凝膠電泳圖

圖9 分離菌卡那霉素耐藥基因aadA1凝膠電泳圖

3 結(jié)論與討論

本研究從2018年初至2019年底養(yǎng)殖戶7次送檢的在當(dāng)?shù)亟?jīng)過抗菌藥物治療沒有效果的病死鵝的肝臟中分離得到7株均為單個(gè)存在、革蘭氏陰性中等大小桿菌，同源性分析結(jié)果顯示：7株分離菌均為腸道沙門氏菌，并且分離株之間同源性較高，可能是由于該菌能夠引起多種動(dòng)物感染發(fā)病，并且該菌在患病動(dòng)物排泄的糞便中含量高，這些病菌可以通過糞便污染土壤、飼料和水等，帶有該菌畜禽糞便可以借助水源散播，鴨、鵝等水禽可以經(jīng)水感染。產(chǎn)蛋種禽如果感染了該菌，能夠通過種蛋將其傳遞給雛禽。送檢病死鵝均來自滁州地區(qū)養(yǎng)殖戶，飼喂的鵝苗有的來自同一家孵化場同一批次種蛋。

從藥敏試驗(yàn)及耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果可知：7株分離菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，均對磺胺類藥物(如：復(fù)方新諾明)耐藥，并且都擴(kuò)增出了磺胺類耐藥基因

sul1

；6株對阿米卡星耐藥，且6株均擴(kuò)增出卡那霉素耐藥基因

aadA1

；2株擴(kuò)增出

blaterm

-

1

基因，3株擴(kuò)增出

β

-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因

baCMY

-

2

，均未擴(kuò)增出喹諾酮耐藥基因

qnr

。藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果一致，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與耐藥基因的存在密切相關(guān)。毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：4株分離菌擴(kuò)增出腸毒素基因

stn

和菌毛素基因

invJ

，3株擴(kuò)增出菌毛素基因

sipA

，均未擴(kuò)增出毒力島基因

misL

和毒力島基因

ssaB

。沙門氏菌的毒力因子有多種，主要包括脂多糖、腸毒素、菌毛、毒力島、毒力質(zhì)粒等。腸毒素是沙門氏菌中重要的致病因子，帶有菌毛的菌株致病力很強(qiáng)，因菌毛具有黏附作用能與纖連蛋白結(jié)合抵抗消化道內(nèi)的殺菌物質(zhì)，從而降低機(jī)體抵抗力。